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帕金森病(Parkinson’s disease,PD),是一种好发于中老年的运动障碍性疾病。PD的主要症状包括静止性震颤、行动迟缓和肌强直,晚期伴抑郁、痴呆、睡眠障碍等非运动症状。PD的主要病理表现为中脑黑质致密区多巴胺能(Dopaminergic,DA)神经元选择性死亡、残留的DA神经元呈现退行性变、神经元的胞浆内出现特征性的Lewy小体。PD尸检表明,α-突触核蛋白(α-synclein)是Lewy小体的主要构成成分,α-synclein的基因突变则导致其异常性聚集,进一步加剧了 DA神经元的损伤,这表明α-synclein对PD的发生发展起着至关重要的作用。Prohibitin(PHB)基因是一种抑癌基因,它的蛋白结构高度保守且广泛分布于生物体内。PHB蛋白在线粒体内膜上会形成环形的复合物发挥分子伴侣的作用,从而维持细胞线粒体结构和功能的完整性。此外,PHB还具调控细胞自噬和衰老的作用,可能参与调控了神经退行性疾病的演变过程。基于以上,我们提出以下疑问:PHB是否对PD中黑质-纹状体系统的损伤具有调控作用?PHB是否调控PD中异常聚集a-synclein的毒性作用?本研究通过用MPP+孵育SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,并在SH-SY5Y细胞内过表达或敲低PHB的表达,检测各组细胞的活力、凋亡和自噬等情况。我们还检测了不同年龄段中A53T转基因PD模型小鼠中脑内PHB的表达情况。本研究在细胞内敲低a-synclein的表达,检测PHB对PD细胞中a-synclein的毒性的调控作用。第一部分:PHB对PD模型中多巴胺能神经元损伤的调控作用目的:研究PHB对PD模型中黑质-纹状体系统损伤的调控作用方法:(1)应用人神经胶质瘤细胞SH-SY5Y建立PD细胞模型,逆转录病毒转染技术在细胞内过表达或敲PHB,将细胞分为正常对照组、PD模型组、PD+PHB+/+、PD+PHB-/-等组。利用CCK-8实验检测细胞活性、ICC观察细胞形态等,检测PHB对PD模型中神经元变性死亡的调控作用。(2)建立A53T转基因PD小鼠模型,以PHB/TH免疫荧光双染的方法检测6、12、18个月龄PD模型和正常小鼠纹状体区PHB和TH的表达情况。(3)收集苏北人民医院神经内科27例确诊为帕金森病患者的血液样本和21例正常人的血液作为对照,以qRT-PCR的方法检测各组血液样本内PHB的表达水平。结果:(1)逆转录病毒转染SH-SY5Y细胞后,PHB的表达增高近350倍;siRNA显著抑制细胞内PHB的表达。(2)MPP+孵育SH-SY5Y细胞后,细胞活性显著下降,细胞的调亡率显著升高。过表达PHB可显著提高PD细胞的活性,抑制细胞的凋亡。PHB敲低后,PD细胞模型的活性显著下降,凋亡显著升高。(3)随着月龄的增加,PD小鼠脑内的PHB表达逐渐增加而TH水平逐渐降低;PHB/TH双染结果显示,PHB和TH共表达于细胞浆内,且随月龄增加PHB的表达增加且呈聚集状,而TH的表达减少。(4)PD患者血液中PHB的mRNA表达水平显著低于正常人的表达水平。结论:PHB可能对帕金森病模型中的多巴胺能神经元具潜在的保护作用。第二部分:PHB对PD模型中a-synclein蛋白异常聚集的调节作用目的:探究PHB对PD模型中a-synclein蛋白异常聚集的调节作用方法:(1)应用人神经胶质瘤细胞SH-SY5Y建立PD细胞模型,用Western Blotting技术检测PD细胞模型中PHB和a-synclein蛋白的表达情况,二者应用Pearson correlation test做相关性分析,分析二者表达水平的相关性。(2)以逆转录病毒转染技术,在SH-SY5Y过表达或敲低PHB的水平,以MPP+孵育各组细胞建立PD细胞模型,利用流式等方法检测各组细胞的形态和凋亡等情况。(3)用Western Blotting的方法检测各组细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bad、cleaved-caspase-3)和自噬相关蛋白(LC3I/II、Beclin等)的表达。(4)用Western Blotting的方法检测A53T PD模型和正常小鼠纹状体区PHB和a-synclein蛋白的表达,二者应用Pearson correlation test做相关性分析。结果:(1)PHB蛋白随着MPP+孵育时间和浓度的增加呈梯度性升高,a-synclein蛋白的表达也呈梯度性增加,两者的表达呈显著的正性相关。(2)PHB过表达可显著抑制PD细胞中凋亡相关蛋白Bad、cleaved-caspase-3,上调Bcl-2的表达,并能抑制PD细胞内的凋亡率。(3)PHB过表达可下调PD细胞中自噬相关蛋白LC3I/II、Beclin的表达。(4)A53T PD模型小鼠脑内的a-synclein随月龄增加逐渐升高,而PHB的表达也升高,PHB与a-synclein呈现显著的正相关性。结论:PHB的高表达可显著提高多巴胺能神经元的细胞活性,抑制细胞凋亡和细胞的自噬应激反应。相反,PHB的含量下降则加速了多巴胺能神经元的变性死亡过程。PHB可能通过抑制多巴胺能神经元内异常聚集的α-synuclein的毒性作用发挥神经保护作用。