【摘 要】
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禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）根据血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的差异可以分为16个HA亚型和9个NA亚型。野鸟是AIV的天然宿主,可以感染所有亚型AIV。对野鸟流感病毒进行监测和评估能够为新发流感病毒的早期预警和防控提供一定的理论依据。H13亚型野鸟流感病毒在我国青海省、山东省和辽宁省等地均有发现,并且
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禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）根据血凝素（Hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的差异可以分为16个HA亚型和9个NA亚型。野鸟是AIV的天然宿主,可以感染所有亚型AIV。对野鸟流感病毒进行监测和评估能够为新发流感病毒的早期预警和防控提供一定的理论依据。H13亚型野鸟流感病毒在我国青海省、山东省和辽宁省等地均有发现,并且经过分析发现部分毒株与鸭源AIV发生重组,具有跨宿主传播的风险。HA蛋白是流感病毒重要的结构蛋白,HA蛋白稳定性可以影响病毒的侵染活性及入侵能力,因此对H13亚型野鸟流感病毒HA蛋白的研究具有重要意义。在研究HA蛋白对病毒生物学特性影响的分子机制时,需要重组或改变病毒的HA基因,这可能会出现生物安全问题。复制缺陷型病毒中缺少部分与病毒复制相关的基因,只能在稳定表达外源蛋白的细胞或动物中复制,保障了流感病毒研究的生物安全性。因此,本研究利用反向遗传技术拯救出H13N8亲本毒株,然后将H13N8亚型野鸟流感病毒的PB2基因大部分编码区替换为增强型绿色荧光报告基因-EGFP基因,救获带有荧光的复制缺陷型病毒H13N8-PB2-KO。H13N8-PB2-KO病毒只能在表达PB2蛋白的细胞中复制,在正常细胞和鸡胚中均不能复制,提高了病毒的生物安全性。研究显示H13N8-PB2-KO病毒和亲本毒株的复制能力等生物学特性相似,并且可以稳定传代6次。本研究选取辽宁分离株A/Eurasian curlew/Liaoning/ZH-385/2014（H13N8）的HA蛋白作为研究对象,进行稳定性分析。H9亚型AIV与H13亚型野鸟流感病毒同属低致病性禽流感病毒,其宿主范围及流行范围广泛。所以,本试验选择辽宁分离株A/chicken/Liaoning/07/2016（H9N2）的HA蛋白作为对照。首先进行HA蛋白酸稳定性实验和热稳定性实验,结果显示与H9N2相比,H13N8的HA蛋白酸稳定性和热稳定性均明显较强。HA蛋白介导细胞融合试验及胰酶敏感性试验的结果显示H13N8的HA蛋白可以被TPCK胰酶裂解,其膜融合p H为5.0,低于H9N2的HA蛋白膜融合p H值。本研究构建了H13N8亚型野鸟流感复制缺陷型病毒,为进一步研究各亚型AIV尤其是高致病毒株的致病及传播等生物特性提供了生物安全保障。对H13N8亚型野鸟流感病毒的HA蛋白稳定性研究发现H13N8亚型野鸟流感病毒较H9N2亚型AIV具有更强的稳定性,为进一步探讨H13N8亚型野鸟流感病毒宿主屏障奠定了基础。
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