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背景和目的:急性心肌梗死因其高发病率,高死亡率和高住院费用的特点,亟需引起我们的关注,为其治疗提供更为完善的方案。尽早恢复梗死心肌血流,挽救受损心肌细胞,即再灌注疗法是目前治疗急性心肌梗死的标准治疗方法。心肌缺血后再灌注可以减少心肌梗死面积,改善长期心肌功能,并减少死亡率。但是心肌缺血后再灌注是一把“双刃剑”,它可加重心脏功能损害,加速心肌细胞的死亡和引起各种恶性心律失常,造成心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。因此,及早治疗心肌I/R损伤对于改善急性心肌梗死患者的预后至关重要。心肌I/R损伤的发展过程涉及多种机制,其中内皮细胞(Endothelial cells,ECS)的损伤,微血管屏障的破坏已被证实是心肌I/R损伤的关键过程。心肌I/R损伤可上调表面粘附分子的表达并招募嗜中性粒细胞聚集,破坏内皮屏障功能增加微血管内皮的通透性,从而加重I/R损伤后引起的心肌炎症和无复流现象。因此,维持内皮细胞的完整性是治疗心肌I/R损伤的潜在靶点。热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)是新发现的热休克蛋白家族的成员,特异性表达于血管内皮细胞,可能参与内皮相关的病理生理过程,并可减轻心肌不可逆再灌注慢性缺血阶段的心脏重塑。但是心肌I/R损伤不同于心肌永久性缺血,有其独特的病理生理过程。课题组前期研究发现HSPA12B对心肌I/R损伤具有保护作用,然而其对急性心肌I/R损伤引起的内皮细胞完整性的影响及其机制并不清楚。本课题在前期实验的结果上进一步研究了 HSPA12B对心肌I/R损伤引起的内皮细胞的完整性的作用,旨在探讨HSPA12B是否通过维持I/R期间内皮细胞的完整性来保护心肌I/R损伤。实验方法:1.实验动物模型:实验采用课题组前期构建的8～10周龄高表达人类hspa12b基因的转基因小鼠(HSPA12B Transgenic,Tg),同窝生雄性野生型鼠(Wild type,WT)做对照。本课题采用南京大学动物模式研究所合作的方式,所用实验动物均饲养于南京大学动物模式所SPF级动物房。2.I/R模型:小鼠用1.5%～2%异氟烷吸入麻醉后,开胸,结扎心脏冠脉左前降支,45 min后解除结扎线为再灌注开始。假手术组(sham组)不结扎心脏冠状动脉左前降支血管,余手术步骤与I/R组相同。3.再灌注期间心肌微血管血流检测:心肌缺血开始再灌注时,用25μ1 FITC标记的番茄血凝素(FITC-labeled Tomato lectin)直接从尾静脉注入小鼠体内。血流重建30min后,取心脏制成新鲜冰冻切片,在乳头肌水平制成4μm横切片,荧光显微镜观察分析。4.伊文斯兰渗透实验(Evan’s blue dye extravasation):心肌缺血后开始再灌注时,按照3.2 μg/g小鼠体重从尾静脉向小鼠体内注射伊文斯兰染料。心肌再灌注30min后,用4%的多聚甲醛从左心室灌注冲洗冠状动脉网,直至右心室流出的灌注液澄清;分离心脏,拍照。心室组织用甲酰胺在60℃条件下震荡溶解24h;离心、取上清读(610nm)吸光度定量渗漏的伊文斯兰量。5.内皮细胞超微结构观察:心脏组织切成1mm2小块,经固定、脱水、包埋、固化等步骤,然后用超微切片机切成60-70nm超薄切片,200目铜网收集,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,透射电子显微镜观察。6.紧密连接蛋白ZO-1的表达:实时定量PCR方法检测心肌组织中ZO-1的mRNA的表达水平,同时采用ZO-1和CD31双重免疫荧光染色方法观察心肌内皮细胞中ZO-1的表达情况。7.中性粒细胞浸润:免疫荧光染色法标记心肌细胞间中性粒细胞浸润情况。8.粘附分子表达水平:实时定量PCR检测心肌粘附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平。9.统计学分析:采用GraphPad Prism6.0处理各组数据。所有数据均以均数±标准差(X±SD)表示,两组数据之间的比较采用t检验,多组数据之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验。P<0.05表示数据间差异有统计学意义。实验结果:1.高表达HSPA12B减少心肌缺血再灌注期间微血管的无复流现象。2.高表达HSPA12B降低心肌I/R损伤引起的血管高通透性。3.高表达HSPA12B升高心肌I/R损伤后抗通透性分子mRNA表达,降低促通透性分子mRNA表达。4.高表达HSPA12B保护心肌I/R损伤后的微血管内皮结构功能的完整性。5.高表达HSPA12B维持心肌I/R损伤后内皮细胞ZO-1的表达。6.高表达HSPA12B减少I/R损伤后心肌中性粒细胞浸润。7.HSPA12B通过调节VCAM-1表达减少I/R损伤后心肌中性粒细胞浸润。结论:HSPA12B减少心肌缺血再灌注损伤引起的中性粒细胞浸润,维持心肌微血管内皮的完整性,从而保护缺血再灌注引起的心肌损害。