第一部分兔视网膜Müller细胞原代培养目的：视网膜Müller细胞是视网膜内最主要的胶质细胞，其贯穿整个视网膜，在视网膜表面形成内界膜，在光感受器内节起始处参与形成外界膜。它的广泛分布及与神经元和微血管内皮细胞的广泛联系，使其在视网膜中承受重要的功能，如营养神经元，调节CO2浓度和PH，钾离子间隙缓冲，合成和更新视色素等。近年研究发现，Müller细胞除在维持视网膜正常的代谢和功能中起重要的作用外，同时也参与多种病理生理过程，如增殖性玻璃体视网膜病变，增殖性糖尿病性视网膜病变和视网膜脱离等。本研究的目的在于探索一种有效的体外分离培养兔视网膜Müller细胞的方法，为进一步研究其在某些疾病中所起的病理生理学作用奠定基础。 方法：采用酶分解的方法从乳兔视网膜获取Müller细胞，DMEM/F12原代培养，通过振荡和反复洗涤培养液使视网膜Müller细胞纯化。采用光镜下形态学观察，神经胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组织化学技术和透射电镜对传代Müller细胞进行鉴定。 结果：培养24小时后即有部分细胞贴壁生长，72小时后贴壁细胞进一步增多。通过振荡吹打可使附着于Müller细胞上的神经元脱落。20～25天后，细胞接近融合，呈三角形或不规则形。传代后细胞经一周达到融合。免疫组化技术显示，培养细胞神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性，阳性率在95％以上。对培养的单层细胞进行电镜观察，结果显示，细胞内含有线粒体，粗面内质网，核糖体及8-10nm的中间丝，证明所培养细胞为Müller细胞。 结论：利用酶消化法可成功分离兔视网膜Müller细胞，通过振荡和吹打洗涤，可使Müller细胞得以纯化，是进一步研究视网膜Müller细胞正常生理和病理反应的可靠材料。 第二部分羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖影响的实验研究目的：在孔源性视网膜脱离，包括视网膜胶质细胞在内的多种细胞的增殖和移行，是形成脉络膜视网膜粘连，封闭视网膜裂孔的关键。Koizumi等研究表明，羊膜上皮细胞和基底膜内含有大量的生长因子如EGF、HGF、KGF、bGFG、TGF-β，且某些生长因子如EGF、bFGF可促进视网膜胶质细胞的增殖和移行。我们采用体外培养兔视网膜Müller细胞，在培养过程中加入不同浓度的羊膜匀浆，观察羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞增殖能力的影响，探讨羊膜用于治疗孔源性视网膜脱离的潜在可能性。 方法：1、取第四代经免疫组化和电镜鉴定的兔视网膜Müller细胞，以3×104/ml密度接种于24孔板，3孔/组，培养24小时后，加入不同浓度羊膜匀浆(800、400、200、100ug/ml)继续培养24小时，胰蛋白酶消化，细胞计数，绘制剂量效应曲线。2、取第四代兔视网膜Müller细胞，以3×104/ml接种于24孔板，3孔/组，24小时后，每孔加入羊膜匀浆(800ug/ml)条件培养基，孵育12、24、36、48、72、96小时后检测，绘制时间效应曲线。3、取第四代兔视网膜Müller细胞以3×104/ml接种于96孔板，200ul/孔，24小时后加入不同浓度羊膜匀浆条件培养基(800、400、200、100ug/ml)，培养24、48、96小时后，用MTT法检测Müller细胞增殖率。4、第四代兔视网膜Muller细胞以4×104/ml密度接种于预置有盖玻片的6孔板中，24小时后加入不同浓度的羊膜条件培养基，继续培养48小时后，免疫组化PCNA检测。 结果：随着条件培养基中羊膜匀浆浓度的增加，对兔视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐增强，800ug/ml时获得最大增殖效应，细胞增殖率为62.5％；在羊膜匀浆浓度恒定条件下，随着时间延长，其对视网膜Müller细胞的增殖效应逐渐加强，在48小时即大到较高的增殖效应，72、96小时与48小时相比无显著差异。细胞增殖抗原检测结果，800ug/ml组和400ug/ml组PCNA抗原阳性表达率与对照组相比具有显著性差异。 结论：羊膜对体外培养的兔视网膜Müller细胞具有促进增殖作用，且呈浓度和时间倚赖性。羊膜治疗孔源性视网膜脱离具有潜在可能性。 第三部分羊膜对兔视网膜Müller细胞EGFR和NGFR表达的影响目的：在脑部损伤和疾病过程中，神经胶质细胞可出现一系列的生物化学改变，如：移行、增殖及星形胶质细胞内神经胶质纤维酸性蛋白表达的增加。在视网膜损伤过程中，Müller细胞发生的变化与脑损伤中星形胶质细胞类似。我们研究了培养条件下兔视网膜Müller细胞EGFR和NGFR的表达情况，以及羊膜作用下对EGFR和NGFR表达的影响，以便进一步探讨羊膜促进视网膜Müller细胞增殖的机理。 方法：采用酶分解法从兔视网膜获取Müller细胞，用含10％FBS的DM/F12原代培养并传代。取第三代Müller细胞，采用免疫组化技术检测羊膜诱导和非诱导条件下兔视网膜Müller细胞EGFR和NGFR表达，并对EGFR和NGFR的表达情况进行对比。 结果：培养的兔视网膜Müller细胞EGFR和NGFR均有表达。经羊膜诱导12小时后，EGFR表达明显增多，而NGFR的表达情况，羊膜诱导与否对其影响不明显。 结论：培养的兔视网膜Müller细胞表达EGFR和NGFR，通过EGF和NGF与其相对应的受体结合，羊膜促进兔视网膜Müller细胞增殖。 第四部分羊膜匀浆治疗兔实验性孔源性视网膜脱离目的：自五十年代以来，视网膜脱离手术发展的核心就是封闭视网膜裂孔和解除玻璃体的牵拉。透热凝固、冷凝和光凝是目前临床上封闭视网膜裂孔的常用方法，通过脉络膜视网膜粘连发生，从而封闭视网膜裂孔。上述三种方法虽能大大提高视网膜脱离手术的成功率，但在临床应用仍有一定局限性。表现为可引起眼内炎症，细胞坏死，增殖性玻璃体视网膜病变等。近年来，各种生物性和合成性组织粘合剂如TGF-β、自体浓缩血小板、自体血清、氰基丙烯酸盐等用于封闭视网膜裂孔，极大地促进了视网膜脱离手术的发展。研究表明，羊膜含有多种生长因子，并能促进视网膜胶质细胞的增生和移行。我们进一步将羊膜用于治疗实验性孔源性视网膜脱离模型，并对其临床和组织病理学结果进行了评价。 方法：30只兔随机分为A、B、C三组，每只兔随机取一眼作为实验组，而另一眼则作为对照组。所有眼均进行经扁平部玻璃体切割，视网膜造孔，液-气交换。实验组视网膜裂孔表面滴加0.1ml羊膜匀浆，而对照组滴加0.1mlPBS，术毕20％SF6眼内填充。术后对所有眼进行间接检眼镜、B型超声临床检查。术后7、14、28天处死动物，摘除眼球，组织切片进行光镜、电镜和免疫组化检查。 结果：术后7天，羊膜匀浆组视网膜复位6眼(60％)，而对照组中无一眼视网膜复位。术后14天，羊膜治疗组中视网膜复位8眼(80％)，对照组中视网膜复位2眼(20％)。术后28天，羊膜治疗组视网膜复位8眼(80％)，而对照组视网膜复位3眼(30％)，具有统计学差异。所有应用羊膜治疗眼术后出现轻度前节炎症反应，经局部应用皮质激素后炎症于3～5天消退。光镜观察，应用羊膜后在视网膜裂孔边缘，有多层成纤维细胞样细胞增殖，与其下脉络膜和视网膜色素上皮细胞发生粘连。而对照组，视网膜裂孔边缘细胞增生明显减少，视网膜不能和脉络膜形成粘连。电镜观察与上述结果一致。成纤维细胞样细胞免疫组化染色显示GFAP阳性。 结论：羊膜匀浆治疗兔实验性视网膜脱离，有助于封闭视网膜裂孔，视网膜复位。裂孔边缘增殖细胞经光镜、电镜、免疫组化证实主要是视网膜胶质细胞。