研究背景与目的： 血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是指由脑血管疾病引起的脑组织梗塞、低灌注或出血所致的认知功能损害综合征。目前，VD已成为老年期痴呆的第二大病因，仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)。随着人口老龄化和脑血管疾病发病率的上升，VD的发病率逐年上升，越来越受到广泛关注。但目前对于VD尚无特效治疗方法。因此对VD发病机制和有效防治方法进行研究具有深远的意义。 神经发生是指神经干细胞( neural stem cell，NSC)在一定条件下增殖分化成神经元，参与神经功能修复的过程。近年来，NSC研究进展迅速，已证实在成年哺乳动物侧脑室室管膜下区( the subventricularzone，SVZ)、海马齿状回颗粒下区(the subgranularzone，SGZ)存在内源性神经干细胞。在一定条件下NSC能够增殖，并向特定方向分化，但增殖的神经细胞不能很好的修复脑部受损结构，对损伤后神经功能的恢复作用也很小。因此，研究内源性神经干细胞神经发生的过程，并寻找刺激神经干细胞增殖分化的方法，将为治疗诸如脑血管病、痴呆、植物状态等中枢神经系统损伤性疾病带来新的希望。 研究发现，某些神经营养因子能够促进神经干细胞的增殖和分化，在神经细胞的发育和再生过程中发挥着不可替代的作用。促红细胞生成素( erythropoietin，EPO)作为一种传统意义上的造血生长因子，除可诱导红系祖细胞增殖分化来治疗贫血以外，还有着造血作用以外的重要生物学作用，产生和分布于中枢神经系统，起到内源性神经保护作用。在中枢神经系统缺血缺氧状态下可检测到EPO的分泌增多，并证实EPO的分泌是脑组织对缺血缺氧的保护机制：EPO治疗可以改善实验动物和肾衰竭透析病人的认知功能。并且EPO在一定条件下能促进神经干细胞生长及存活。然而，迄今为止有关EPO治疗对VD大鼠认知功能影响及神经发生的研究甚少。为此，本文建立了VD动物模型，从行为学和组织形态学方面探讨EPO治疗对VD大鼠神经发生和认知功能的影响。本实验采用穿梭箱检测大鼠认知功能、采用免疫组织化学法观察大鼠海马区神经干细胞增殖分化情况、采用western-blot方法检测细胞因子BDNF、VEGF蛋白表达情况，探讨EPO治疗后对VD大鼠神经发生及认知功能改善的机制，为临床血管性痴呆的治疗提供新的方法和思路。 材料与方法： 第一部分：EPO对血管性痴呆大鼠认知功能及细胞因子分泌的影响 1.EPO对VD大鼠认识功能的影响 实验动物选取清洁级SD大鼠45只。随机分为三组：对照组、VD组和治疗组。造模后治疗组大鼠腹腔内注射thEPO(50001U/kg)，每天1次，连续7天。其余两组给予等量生理盐水腹腔注射。各组大鼠均采用穿梭箱系统进行训练。本实验中大鼠的学习记忆能力以完成主动回避反应的次数与测试总次数(20次)的比值为代表，即主动回避反应率(Active avoidance reaction ratio，AAR ratio)。于造模前、造模后1周、2周和4周各时相点行穿梭箱检测。 2.EPO对VD大鼠BDNF、VEGF表达的影响 实验动物选取清洁级SD大鼠15只，随机分为三组：对照组、VD组和治疗组。造模后治疗组腹腔内注射thEP0(50001U/kg)，每天1次，连续7天。其余两组给予等量生理盐水腹腔注射。于造模后2周使用western blot方法检测大鼠海马BDNF、VEGF表达的变化。 第二部分；EPO对血管性痴呆大鼠神经发生的影响 1.EPO对VD大鼠神经干细胞增殖的影响 实验动物选取清洁级SD大鼠45只。随机分为三组：对照组、VD组和治疗组。每组取造模后1周、2周和4周3个时楣点(n=5)。采用5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)标记法(50mg/kg体重，腹腔注射，每日2次持续7天)标记处于有丝分裂S期细胞。治疗组给予腹腔内注射thEPO(50001U/kg)，每天1次，连续7天。免疫组化法检测BrdU表达水平，进行细胞计数，检测EPO对VD大鼠海马细胞增殖的影响。 2.EPO对VD大鼠神经干细胞分化的影响 实验动物选取清洁级SD大鼠45只。随机分为三组：对照组、VD组和治疗组。每组取造模后1周、2周和4周3个时相点(n=5)。采用5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)标记法标记处于有丝分裂S期细胞，治疗组给予腹腔内注射thEP0(50001U/kg)，每天1次，连续7天。免疫荧光双标法法检测BrdU阳性细胞类型，采用BrdU/DCX、BrdU/NSE双标分别标记BrdU阳性细胞中未分化成熟及分化成熟的神经元的比例。 结果： 一、EPO对VD大鼠认识功能的影响 穿梭箱结果显示造模前各组大鼠AAR比率无明显差异。造模后VD组大鼠AAR比率显著低于对照组；治疗组大鼠AAR比率显著低于对照组，但高于VD组，且随着造模后时间的推移逐渐升高。提示EPO对VD大鼠的认知功能缺失有改善作用。 二、EPO对VD大鼠BDNF、VEGF表达的影响 造模后2w大鼠脑标本免疫印迹结果显示，VD组和对照组BDNF、VEGF含量无明显差别，而治疗组BDNF、VEGF含量较VD组及对照组明显增加。提示EPO有促进VD大鼠脑内细胞因子BDNF、VEGF表达的作用。 三、EPO对VD大鼠海马区细胞增殖的影响 免疫组化结果显示造模后1周，BrdU标记阳性细胞主要分布于海马颗粒下层，形状不规则，紧密排列，成簇出现。VD组BrdU标记阳性细胞数明显多于对照组，治疗组BrdU标记阳性细胞数明显高于VD组；造模后4周，对照组大鼠BrdU标记阳性细胞无明显变化。VD组和治疗组BrdU标记阳性细胞主要分布在颗粒下层和颗粒层，两组BrdU标记阳性细胞数量均较前明显下降。VD组BrdU标记阳性细胞数量下降更为明显，与对照组无明显差异，治疗组BrdU标记阳性细胞数量下降幅度最小，BrdU标记阳性细胞数量明显多于其余两组。 四、EPO对VD大鼠海马区细胞分化的影响 免疫荧光双标对BrdU标记阳性细胞进行鉴定，发现造模后1周，治疗组BrdU/DCX免疫荧光双标阳性细胞数明显高于VD组，各组间BrdU/DCX双阳性细胞百分比比较无明显差异；造模后4周，治疗组大鼠BrdU/NSE免疫荧光双标阳性细胞数明显高于VD组，各组间BrdU/NSE双阳性细胞百分比比较无明显差异。 结论： 1、行为学结果显示VD大鼠认知功能明显降低；给予EPO治疗后VD大鼠认识功能得到显著改善； 2、VD大鼠脑内BDNF、VEGF蛋白表达与对照组没有明显差异：给予EPO治疗后，VD大鼠脑内BDNF、VEGF蛋白表达明显增加； 3、免疫组化及免疫荧光检测证实，EPO可以促进VD大鼠海马区神经干细胞增殖，但对其分化影响不明显。