三斑海马是一种小型海洋硬骨鱼,隶属于海龙科,主要生活在热带和亚热带浅海域。三斑海马作为一种名贵的海洋中药材,素有“南方人参”之称,具有抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、抗炎等保健功能。本研究以南海特色资源三斑海马为研究对象,从海马总脂中分离出糖脂,经过皂化、酸水解得到长链碱,然后从诱导细胞凋亡方面探讨其体外抗肿瘤作用,并进一步分析其诱导细胞凋亡的分子机制。主要研究和结果内容如下:1.三斑海马长链碱的分离纯化及结构鉴定首先通过超声波萃取法,从三斑海马中提取总脂;除杂后经过中压硅胶柱层析,得到糖脂;接着将糖脂皂化、酸水解,得到海马长链碱粗品;通过中压硅胶柱线性洗脱和HP-20大孔树脂脱色,获得纯化的长链碱。通过薄层层析法(TLC)、红外光谱分析仪(FTIR)和GC-MS法分析海马长链碱的基本组成和分子结构。TLC结果发现,三斑海马长链碱在薄层板上出现清晰单一的紫红色斑点,说明长链碱中的-NH2和茚三酮反应生成紫红色物质;通过FTIR图中吸收峰位置推测长链碱的特征官能团;最后通过GC-MS法分析海马长链碱的基本组成及分子结构,发现三斑海马长链碱的主要形式是d16:0、d18:0和d18:2。2.三斑海马长链碱的体外抗肿瘤活性首先以人慢性髓原白血病K562细胞为体外肿瘤细胞模型,研究三斑海马长链碱对细胞存活率的影响。结果发现,不同浓度长链碱处理K562细胞后,细胞存活率显著降低。当长链碱处理细胞24和48 h后,其半数抑制率IC50分别为37.17和31.01 μg/mL。接着使用流式细胞分析仪研究了长链碱对K562细胞凋亡率的影响。结果发现,长链碱作用K562细胞24h后,K562细胞凋亡率升高,呈剂量依赖效应,说明长链碱的抗肿瘤活性是通过诱导细胞凋亡实现的。细胞周期的研究结果发现,不同浓度长链碱处理细胞后,sub-G0/G1(凋亡峰)期的细胞数目呈上升趋势,S期的细胞群逐渐增加;表明三斑海马长链碱能诱导K562细胞的凋亡,且可以将其阻滞于S期。以上研究结果表明长链碱的体外抗肿瘤与其诱导肿瘤细胞的凋亡相关。3.三斑海马长链碱诱导细胞凋亡的机理首先采用RT-PCR研究了三斑海马长链碱对细胞内促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表达的影响。结果发现,长链碱处理K562细胞24h后,Bcl-2的mRNA表达量下降而Bax上升,因此Bcl-2/Bax比值下降,两者比值的下降可能导致线粒体膜电位下降。因此,接下来研究了海马长链碱对线粒体膜电位的影响。结果发现,随着长链碱浓度的增加,其荧光强度降低,即线粒体的膜电位降低。线粒体膜电位的下降会促进细胞色素C的释放,与caspase-9形成凋亡小体,从而激活caspase的级联反应。最后,通过Western blot和RT-PCR研究了细胞内caspase-3、8和9的表达情况。结果发现,随着长链碱浓度的增加,细胞内caspase-3、8和9的表达也随之增加,表明线粒体凋亡通路激活启动者caspase-9,进一步激活效应者caspase-3,从而诱导细胞凋亡,表明线粒体凋亡通路可能参与三斑海马长链碱诱导的细胞凋亡;同时长链碱处理K562细胞后,细胞内caspase-8 mRNA表达量的升高,说明长链碱也可能是通过死亡受体通路诱导细胞凋亡。以上结果说明线粒体凋亡通路和死亡受体通路均参与三斑海马长链碱诱导的细胞凋亡。4.三斑海马长链碱对细胞内COX-2表达的影响采用ELISA法测定三斑海马长链碱对K562细胞内COX-2蛋白表达的影响。结果发现三斑海马长链碱处理K562细胞24h后,细胞内COX-2的蛋白表达量下降。说明三斑海马长链碱通过抑制细胞内COX-2的蛋白表达,抑制新生血管的形成,促进K562细胞的凋亡,从而抑制白血病细胞的恶性增殖。