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[目的]检测硫化氢荧光探针CouMC与牙源性间充质干细胞的结合能力:比较不同牙源性间充质干细胞内源性硫化氢含量的区别;通过检测牙源性间充质干细胞成骨分化过程中内源性硫化氢含量的改变,以及外源性硫化氢对牙源性间充质干细胞成骨分化过程的影响,探究硫化氢在牙源性间充质干细胞成骨分化过程中所起的作用;通过在牙源性间充质干细胞成骨分化过程中分别加入SB431542与TGF-β 1,检测硫化氢含量的改变,以探究在牙源性间充质干细胞成骨分化过程中TGF-β信号通路与硫化氢含量之间的关系。[方法]本干细胞研究拟通过医院伦理委员会审议,所有临床标本获取前患者均签署知情同意书。从牙体组织与牙周支持组织的临床样本中培养获取原代细胞,并进行形态学与细胞表面标志物检测,以判断是否满足间充质干细胞的鉴定条件。为了检测牙龈干细胞(hGMSCs)的体外成骨分化能力,进行成骨诱导培养与茜素红染色实验。为了检测不同牙源性间充质干细胞内硫化氢的含量,使用CouMC探针结合流式细胞术分别对牙龈干细胞(hGMSCs)、根尖乳头干细胞(hSCAPs)、牙囊干细胞(hDFCs)的内源性硫化氢进行检测。为了检测牙源性间充质干细胞成骨分化过程中内源性硫化氢含量的改变,以及TGF-β信号通路与硫化氢含量之间的可能联系,我们取hGMSCs与hSCAPs进行流式细胞术检测,实验各分为四组;对照组、成骨组、SB组与TGF-β组,分别用间充质干细胞培养基、成骨诱导培养基、含SB431542的成骨诱导培养基与含TGF-β1的成骨诱导培养基处理,并使用CouMC探针结合流式细胞术分别检测hGMSCs与hSCAPs不同处理组在培养3天和7天后内源性硫化氢的含量。为了检测外源性硫化氢对hGMSCs与hSCAPs成骨分化的影响,以及细胞内胱硫醚β合酶(CBS)与胱硫醚γ裂解酶(CSE)表达的改变,我们取hGMSCs与hSCAPs,实验各分为八组:对照组、成骨组、SB组、TGF-β组、对照+外源性H2S组、成骨+外源性H2S组、SB+外源性H2S组与TGF-β+外源性H2S组,并进行蛋白质免疫印迹检测CBS、CSE与Runx2的蛋白表达,其中CBS与CSE是与硫化氢生成相关的酶,Runx2则是一种与成骨相关的特异性转录因子。[结果]从牙体与牙周支持组织中培养获取的原代细胞为贴壁、克隆性生长,形态多为梭形;流式细胞术检测牙龈组织来源细胞的表面标志物CD73(98.05%)、CD90(98.48%)阳性表达,CD34、CD45阴性表达:根尖乳头组织来源细胞的表面标志物CD73(99.8%)、CD90(99.7%)阳性表达,CD34、CD45阴性表达;牙囊组织来源细胞的表面标志物CD73(99.4%)、CD90(99.8%)阳性表达,CD34、CD45阴性表达,以上两方面符合间充质干细胞的鉴定条件。hGMSCs成骨诱导培养与茜素红染色实验,结果显示hGMSCs成骨诱导分化后可见大量明显的矿化结节。使用硫化氢荧光探针CouMC分别对hGMSCs、hSCAPs、hDFCs细胞内的硫化氢含量进行流式细胞术检测,结果显示不同牙源性间充质干细胞的内源性硫化氢含量不同。使用CouMC探针结合流式细胞术检测hGMSCs与hSCAPs不同处理组的内源性硫化氢含量,结果示:hGMSCs与hSCAPs成骨组、SB组与对照组相比内源性硫化氢含量下降,且SB组内源性硫化氢含量的下降更为明显。Western Blot检测hGMSCs与hSCAPs细胞CBS、CSE、Runx2的蛋白表达,结果示:hGMSCs对照+外源性H2S组与对照组相比,Runx2的表达明显升高;hGMSCs成骨组、SB组、TGF-β组与对照组相比,CBS的表达明显升高;hSCAPs对照+外源性H2S组与对照组相比,Runx2的表达明显升高;hSCAPs成骨组与对照组相比,CBS的表达明显升高;hSCAPs TGF-β+外源性H2S组与TGF-β组相比,CBS的表达升高,其余组间未见显著性差异。[结论]本实验研究条件下,硫化氢荧光探针CouMC可作为牙源性间充质干细胞内硫化氢含量的检测手段,达到快速响应,实时检测,定量分析且不损伤细胞的目的;不同牙源性间充质干细胞的内源性硫化氢含量不同;外源性硫化氢能够促进hGMSCs与hSCAPs成骨转录因子Runx2蛋白表达,从而提高其体外成骨分化能力;在牙源性间充质干细胞成骨分化过程中,TGF-β信号通路相关蛋白对硫化氢及其生成酶有一定的调控作用,但具体关系仍需进一步深入的实验证明。