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第一部分 BRD4基因在儿童T-ALL中的表达及临床意义目的:本研究通过转录组测序和定量PCR技术检测儿童T系急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者骨髓标本中BRD4 mRNA的相对表达量,并与儿童T-ALL的临床特征进行相关分析,明确BRD4在儿童T-ALL中的临床意义。方法:1.通过肿瘤细胞系数据库（https://portals.broadinstitute.org/ccle）调研不同类型肿瘤细胞株BRD4 mRNA表达情况;采用实时荧光定量PCR方法检测急性白血病细胞株中BRD4 mRNA表达水平。2.选取2012年6月至2017年12月期间入住苏州大学附属儿童医院的初诊T-ALL且接受CCLG-ALL 2008方案治疗的患者62例和健康儿童骨髓供者9例。利用实时荧光定量PCR方法检测16例T-ALL临床样本、9例正常骨髓和多种白血病细胞株中BRD4基因的表达水平;采用转录组测序技术检测46例T-ALL患儿中BRD4基因的转录水平,结合临床资料,分析其在T-ALL中的表达差异及与预后的相关性。结果:1.不同类型肿瘤细胞株BRD4 mRNA均高表达,无肿瘤特异性。2.在儿童T-ALL中,BRD4 mRNA表达水平升高与预后不良相关。通过比较BRD4高表达和BRD4低表达组间总生存时间发现,BRD4高表达组患者较BRD4低表达组患者总生存期明显缩短（p=0.045）;进一步比较两组间无复发生存时间,发现BRD4高表达患者与低表达患者相比较虽无统计学差异,但是总体时间缩短。3.多因素logistic回归分析,发现BRD4 高表达患者的死亡风险是低表达患者的4倍。结论:BRD4基因普遍表达于肿瘤细胞中。在儿童T-ALL中,BRD4基因高表达是临床预后不良的因素。第二部分 BRD4基因在T-ALL中生物学功能研究目的:前期的临床资料显示BRD4在T-ALL患者中是预后不良因素,但作用机制尚不清楚。本研究通过体内外沉默T-ALL细胞中BRD4表达,探讨BRD4基因在T-ALL细胞中的生物学功能。方法:1.通过慢病毒构建BRD4敲低T-ALL细胞以及采用BRD4降解剂ARV-825处理获得BRD4干扰T-ALL细胞,进一步通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定细胞株中BRD4表达水平。2.采用CCK-8法检测BRD4干扰后T-ALL白血病细胞和原代细胞的增殖;流式细胞分析仪检测BRD4干扰后细胞周期、细胞凋亡,同时利用蛋白免疫印迹法检测与凋亡相关蛋白分子表达水平。3.在HEK293T细胞中包装敲低CRBN和过表达CRBN慢病毒颗粒,在6T-CEM、Jurkat和Molt4细胞中感染CRBN敲低和CRBN过表达病毒颗粒,用蛋白免疫印迹法分别检测CRBN蛋白表达水平,CCK-8法检测ARV-825处理CRBN过表达和CRBN敲低T-ALL白血病细胞的细胞活力;加用蛋白酶抑制剂MG132处理细胞后,通过蛋白免疫印迹法检测BRD4蛋白水平。4.在裸鼠中,通过皮下接种方式建立白血病细胞移植瘤模型,小鼠体内观察ARV-825 的药物毒性及对白血病移植瘤的作用;并用蛋白免疫印迹法检测 BRD4 蛋白在肿瘤组织中的表达,同时采用免疫组化方法检测肿瘤组织中Ki67和活化caspase 3的表达水平。结果:1.经实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法鉴定,证实成功获得稳定敲定BRD4的T-ALL细胞;采用蛋白免疫印迹法证明,ARV-825处理细胞可以获得BRD4减低细胞。2.CCK-8实验显示在T-ALL细胞中,BRD4表达减低能显著抑制T-ALL细胞的增殖能力。3.BRD4干扰后细胞主要阻滞在G0/G1期。流式分析显示BRD4表达减低,则细胞发生凋亡的比例增加,同时相应凋亡标志蛋白PARP和caspase 3也发生激活,与表型一致。4.BRD4降解剂ARV-825通过降解BRD4蛋白,可以促使T-ALL细胞增殖受抑和诱导细胞凋亡。该作用需要依赖E3泛素化连接酶CRBN的帮助,ARV-825抗肿瘤能力与CRBN表达水平相关,而蛋白酶抑制剂MG132可以逆转ARV-825降解BRD4蛋白的水平。5.BRD4降解剂ARV-825在裸鼠移植瘤模型中,对裸鼠重要脏器及体重无明显影响;BRD4降解剂ARV-825能显著抑制肿瘤组织中BRD4蛋白的表达,并抑制Ki67的表达的和促进cleaved caspase 3的激活,从而抑制T-ALL移植瘤的增长。结论:体内外实验证明BRD4基因是维持T-ALL细胞存活的重要基因;BRD4降解剂ARV-825在蛋白酶CRBN的帮助下能有效降解BRD4蛋白表达从而产生抗肿瘤效应。第三部分 BRD4基因在T-ALL中的作用机制研究目的:前期研究发现BRD4是T-ALL不良的预后因素,通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡影响肿瘤细胞的生长,但其详细的分子作用机制尚不完全清楚。本研究采用转录组测序联合ChIP测序技术进行深入研究。方法:1.通过转录组测序技术寻找BRD4干扰细胞的差异基因,采用GSEA进行差异基因信号通路富集,蛋白免疫印迹法进一步验证BRD4和c-Myc蛋白在细胞水平的表达。2.通过ChIP-seq技术分析BRD4干扰细胞和儿童T-ALL临床标本中超级增强子相关基因;进一步利用增强子分析与基因表达分析相结合方式获得BRD4 下游靶基因,采用实时荧光定量PCR法进行验证。3.通过慢病毒载体构建IGLL1-ShRNA载体,采用实时荧光定量PCR法鉴定IGLL1稳定表达6T-CEM细胞,CCK-8法检测IGLL1表达减低细胞的增殖;使用流式细胞仪检测IGLL1转染细胞的细胞凋亡。结果:1.转录组测序数据分析显示ARV-825降解BRD4后通过H3K27Ac介导了 c-Myc转录抑制,在细胞水平c-Myc分子受抑也得到了进一步验证;2.通过ChIP-seq技术分析发现IGLL1是原代T-ALL细胞中的超级增强子相关基因,进一步结合BRD4减低细胞株的ChIP-seq和RNA-seq数据分析,提示IGLL1是受BRD4基因影响最明显基因。在细胞水平功能研究,发现IGLL1基因表达水平与细胞增殖能力相关。结论干扰BRD4在T-ALL中的作用与靶基因c-Myc转录受抑有关;另外,干扰BRD4引起的细胞增殖能力减低也可能是通过靶基因IGLL1转录水平的改变而引起,后期需要我们更多的实验进行验证。