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第一部分:薯蓣皂苷元对前列腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响目的:明确薯蓣皂苷元在不同浓度、不同时间条件下对前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,证实薯蓣皂苷元可调控前列腺癌细胞生物学行为。方法:利用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴容盐比色分析（MTT）方法测定薯蓣皂苷元在不同药物浓度下（0 μ M、25 μ M、50 μ M、75 μ M、100 μ M）对前列腺癌细胞株PC3细胞增殖影响,明确半数有效抑制浓度（IC50）即后续实验所需药物浓度。采用流式细胞仪及AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测薯蓣皂苷元不同药物浓度对PC3细胞凋亡及细胞周期作用。结果:薯蓣皂苷元可明显抑制PC3细胞增殖,抑制效果与薯蓣皂苷元药物浓度呈正相关,其IC50为50μM。薯蓣皂苷元可诱导PC3细胞凋亡,在50 μ M、75 μM浓度下,其PC3细胞凋亡率较对照组的3.25%增加至8.72%和18.81%;薯蓣皂苷元诱导PC3细胞周期停滞于G2/M,与对照组相比,50 μM、75 μM浓度下处于G2/M周期细胞比例升高至17.21%和29.67%。结论:薯蓣皂苷元在不同药物浓度下可抑制PC3细胞增殖,其抑制效果与药物浓度呈正相关;不同薯蓣皂苷元药物浓度可诱导PC3细胞凋亡,并使细胞周期停滞于G2/M 期。第二部分薯蓣皂苷元通过下调NEDD4蛋白表达抑制前列腺癌细胞侵袭及迁移目的:明确薯蓣皂苷元对前列腺癌细胞PC3侵袭及迁移的作用,探寻薯蓣皂苷元调控NEDD4细胞信号传导通路对PC3细胞侵袭及迁移的机制。方法:1、创伤愈合试验采用6孔板平铺PC3细胞培养,细胞密度达90%以上划痕,每孔三处划痕并标记,分别在0h,20h拍摄划痕区域,相互比对,利用Image软件统计分析。2、侵袭试验采用24孔Transwell小室对处理后的PC3细胞进行侵袭实验,小室上层为无血清RPMI培养基,下层为20%高血清RPMI培养基,孵育20h后,对膜表面细胞行Calcein-AM染色20分钟,光镜下计数,重复三次后统计学分析。3、蛋白印迹实验6孔板培养PC3细胞,经72h培养后,细胞裂解,蛋白定量,行蛋白印迹实验（westernbolt）分析测定NEDD4蛋白及其相关通路蛋白表达情况。结果:1、薯蓣皂苷元可抑制PC3细胞迁移和侵袭划痕实验证实:薯蓣皂苷元在50 μ M,75μM浓度下,PC3细胞与对照组相比,侵袭性明显减低,P＜0.05,具有统计学差异。Transwell实验证实,薯蓣皂苷元在50 μM、75 μM浓度下,PC3细胞迁移能力明显低于对照组,具有统计学差异（P＜0.05）。2、薯蓣皂苷元抑制NEDD4表达Westernblot分析表明:薯蓣皂苷元以50 μM、75 μ M浓度作用PC3细胞,NEDD4蛋白表达明显降低,其下游蛋白p73表达明显增加,p-AKT蛋白表达降低,LATS1蛋白表达增高,TAZ蛋白表达降低。结论:1、薯蓣皂苷元可以抑制前列腺癌PC3细胞的迁移和侵袭,均呈浓度依赖性;2、薯蓣皂苷元可抑制前列腺癌PC3细胞NEDD4蛋白的表达,显著增加p73蛋白的表达并降低p-Akt蛋白表达,同时增加LATS1蛋白表达并抑制TAZ蛋白表达。第三部分NEDD4蛋白在薯蓣皂苷元抑制前列腺癌细胞增殖及迁移中的作用机制目的:明确NEDD4蛋白对薯蓣皂苷元抑制前些腺癌PC3细胞增殖及迁移中作用,证实NEDD4细胞信号传导途径对薯蓣皂苷元抑制前列腺癌PC3细胞增殖及迁移的具体作用机制。方法:1、构建NEDD4过表达质粒、空载体质粒,采用瞬时转染方式,转染PC3细胞,Westernblot验证NEDD4过表达质粒表达及p73,p-Akt,LATS1表达差异。MTT分析测定过表达NEDD4的PC3细胞株细胞凋亡及细胞周期变化。划痕实验测定过表达NEDD4的PC3细胞株迁移改变。Transwell实验验证此细胞株细胞侵袭差异。2、构建过表达NEDD4质粒,空载对照质粒,采用瞬时转染PC3细胞方式,Westernblot验证表达后,分别分为对照组（空载质粒）,薯蓣皂苷元处理组,转染NEDD4过表达质粒组,薯蓣皂苷元联合NEDD4过表达质粒组,同样采用Westernblot测定四组PC3细胞内NEDD4,p73,p-Akt,LATS1的蛋白改变情况,MTT法分析检测细胞增殖情况变化,流式及凋亡试剂盒检测细胞周期及凋亡率,划痕实验验证细胞侵袭,Transwell实验验证细胞迁移变化。3、构建NEDD4基因小干扰RNA（siRNA）及小干扰对照质粒（siCtrl）,同时采用瞬时转染方式,Westernblot验证干扰效率及NEDD4蛋白,p73,p-Akt,LATS1的蛋白改变情况,MTT法分析检测细胞增殖情况变化,流式及凋亡试剂盒检测细胞周期及凋亡率,划痕实验验证细胞侵袭,Transwell实验验证细胞迁移变化。4、构建NEDD4基因小干扰RNA（siRNA）及小干扰对照质粒（siCtrl）,WB验证表达后,分别分为对照组（siCtrl）,薯蓣皂苷元处理组,敲低NEDD4基因组（NEDD4-siRNA）,薯蓣皂苷元联合敲低NEDD4基因组（NEDD4-siRNA）,同样采用WB测定四组PC3细胞内NEDD4,p73,p-Akt,LATS1的蛋白改变情况,MTT法分析检测细胞增殖情况变化,流式及凋亡试剂盒检测细胞周期及凋亡率,划痕实验验证细胞侵袭,Transwell实验验证细胞迁移变化。结果:1、NEDD4cDNA转染上调NEDD4表达,并可逆转薯蓣皂苷元的抑制细胞增殖、影响细胞周期停滞和诱导细胞凋亡的作用（P＜0.05）。可逆转下游p73、p-Akt、LATS1蛋白的表达（P＜0.05）;2、上调NEDD4表达,可显著消除薯蓣皂苷元抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的作用（P＜0.05）;3、NEDD4siRNA转染PC3细胞显著下调NEDD4表达,联合薯蓣皂苷元和NEDD4 siRNA处理,PC3细胞中NEDD4、p-Akt表达较两者单独处理显著下降（P＜0.05）,而p73、LATS1 则显著增加（P＜0.05）;4、沉默NEDD4表达,可显著增强薯蓣皂苷元抑制前列腺癌细胞侵袭和转移的作用（P＜0.05）。结论:1、过表达NEDD4可显著逆转薯蓣皂苷元所致PC3细胞增殖、凋亡及细胞周期改变。可逆转下游p73、p-Akt、LATS1蛋白的表达;2、过表达NEDD4可显著消除薯蓣皂苷元抑制前列腺癌细胞侵袭和迁移的作用;3、沉默NEDD4表达可显著增强薯蓣皂苷元抑制PC3细胞的作用（包括抑制细胞增殖,促进凋亡以及抑制细胞侵袭迁移）;4、薯蓣皂苷元通过介导NEDD4蛋白表达,调控NEDD4/P73/p-AKT/LATS1通路,影响PC3细胞增殖及转移等生物学行为。第四部分:蛋白质组学方法初步探究E3泛素连接酶的表达情况目的:利用蛋白组学分析方法,对高危前列腺癌组织及癌旁组织行高通量测序技术（下一代测序技术）（Next-generation sequencing technology,NGS）检测,利用生物信息学软件,分析异常表达的差异化蛋白。方法:1、收集3份高危前列腺癌（High-risk prostate cancer,HRPC）（3份,S1,S2,S3）及其癌旁组织（3份,C1,C2,C3）新鲜样品,进行人癌组织蛋白质组学检测及生物信息学分析,基于蛋白质非标记定量技术（Label-Free Quantification）,通过液质联用技术直接对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,筛选差异表达蛋白。2、基于两组的差异蛋白（或者不同差异倍数的差异蛋白）功能富集的聚类分析,研究其在特定功能（GO,KEGG通路,蛋白结构域等）上存在的潜在联系和差异。3、通过蛋白质网络图展现得到的蛋白质之间整个的网络图,每一个节点代表一个蛋白质。提交每组差异蛋白名至STRING官网。提交NEDD4与FOXB2至STRING官网。结果:1、共鉴定到5255个蛋白质组（卡值标准:Peptide Threshold 1.0%FDR,1 Unique Peptide）,鉴定蛋白数量正常。差异蛋白共28个,其中下调16个,上调12个;2、在高危前列腺癌标本里E3泛素连接酶蛋白家族成员APC4和FOXB2均高表达,差异显著;3、NEDD4与FOXB2提交至STRING官网显示两者之间存在相互作用。结论:1、E3泛素连接酶蛋白家族成员FOXB2在高危前列腺癌（HRPC）中高表达;2、FOXB2与NEDD4具有相互作用;3、E3泛素连接酶蛋白家族在高危前列腺癌发生、发展过程中可能发挥重要作用。