研究背景：骨再生是由成骨细胞、破骨细胞和其他多种细胞及细胞因子参与的复杂的修复过程,其核心是破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成的一个动态平衡过程。骨折后的愈合和贯穿人一生的骨代谢都是靠骨再生过程来完成的。然而,中年后随着年龄增长由于骨吸收速度大于骨形成速度所造成的骨质疏松、以及由于骨形成停滞造成的骨折后延迟愈合甚至骨不连等疾病一直是困扰医务工作者的难题。近年来,参与及调控骨再生过程中的细胞因子已成为人们研究的热点,而作为激发骨折愈合起始阶段并起着重要作用的促炎症因子在骨再生中的作用机理还未被很好地阐明。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)都是骨再生过程中重要的促炎症因子。LPS,可诱导多种炎症因子的释放。LPS对细胞及组织的作用被喻为“双刃剑”。早期的研究表明LPS能直接导致细胞及组织的凋亡或坏死,而最新的研究发现低浓度的LPS又可促进细胞或组织的增殖。而低浓度的LPS是否能促使成骨细胞增殖还鲜有报道。PGE2,一直是研究骨再生过程中的热点,内源性和外源性的PGE2、体外和体内PGE2在骨再生过程中的作用各不相同。PGE2促进骨吸收的作用研究已相对成熟,而其在成骨方面的作用机制还未被阐明。NF-κB,是广泛存在于胞浆中的一种快反应转录因子,通常以p65-p50二聚体的形式存在,在LPS等外界因素刺激成骨细胞分泌PGE2的同时,往往伴随着NF-κB的活化,而抑制其活化可阻碍由于雌激素缺乏造成的骨丢失。本课题将研究LPS、PGE2和NF-κB在成骨细胞增殖和分化以及在体内骨折愈合中的相互作用。目的：探讨LPS和PGE2两种促炎症因子在骨再生过程中的作用及信号途径,试图找到一个关键性的靶点,为以后基因治疗骨不连、骨延迟愈合等疾病提供基础实验支持。方法：1.采用500 ng/mL的LPS、500ng/mL的LPS和COX-2抑制剂sc791、500ng/mL的LPS和NF-κB抑制剂BAY11-7082分别处理MC3T3-E1成骨细胞1h、6h和12h。采用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期,利用RT-PCR和westernblot法检测和比较LPS对成骨细胞NF-κB mRNA和蛋白水平的变化,采用western blot法检测各组细胞NF-κB、COX-2蛋白表达的变化,利用免疫荧光和EMSA法检测各组细胞NF-κB蛋白核转移情况和活力的变化情况。2.采用10μmol/L PGE2、5μmol/L BAY 11-7082和10μmol/L PGE2分别处理MC3T3-E1成骨细胞30 min,2 h和4 h。通过MTT法检测细胞增殖活力,利用流式细胞检测法检测各组的细胞周期和凋亡率变化,通过检测细胞ALP活力了解细胞的分化情况,采用western blot法检测各组细胞NF-κB、BMP-7和Id2蛋白的表达、利用免疫荧光和EMSA法检测各组细胞NF-κB蛋白的核转移和活力变化。3.采用wistar大鼠造桡骨骨折模型,用BAY11-7082进行局部骨折部位注射干预,分别于3 d,7 d,14 d和28 d取出骨痂组织,检测骨痂组织ALP活力了解其成骨情况,采用elisa法检测骨痂组织PGE2含量,利用western blot法检测骨痂组织中NF-κB、BMP-7和Id2蛋白的表达情况,利用组织切片HE染色法观察14 d和28 d时处理组和非处理组骨痂组织结构。4.10μmol/L PGE2处理细胞30 min后,收集正常对照组和处理组的细胞,用TRIZOL冰上悬浮后立即转交至上海生物芯片公司做RNA的提取、RNA的检测和基因芯片的杂交。本课题采用的基因芯片为美国西北大学基因芯片中心实验室制备的人类全基因组芯片,芯片包含34995个基因探针点。芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描,Feature extraction软件读取数据后进行Normalize处理分析。将Ratio≥2或≤0.5, p Value Log Ratio<0.01作为表达差异显著的基因。结果：1.500 ng/mL LPS处理细胞6 h、12 h后,细胞的增殖指数有显著性增高(P<0.01), COX-2抑制剂sc791不能抑制由LPS诱导的成骨细胞增殖,NF-κB抑制剂BAY 11-7082可显著抑制由LPS诱导的成骨细胞增殖。LPS处理成骨细胞6 h后,NF-κB的mRNA表达与对照组比较无显著差异(P>0.05),蛋白表达水平与对照组相比有显著的增高(P<0.01),说明LPS作用在成骨细胞NF-κB的蛋白水平,而不是在mRNA水平。LPS处理成骨细胞后NF-κB发生核易位和活力的增强,而COX-2蛋白的表达与对照组比较无显著变化(P>0.05), sc791并不能抑制由LPS诱导的NF-κB活力增强,说明低浓度的LPS是通过非COX-2依赖的NF-κB途径诱导成骨细胞增殖的。2.10μmol/L PGE2处理成骨细胞2 h和4 h时,细胞增殖活力与对照组比较有显著下降(P<0.01),而细胞的ALP活力较正常组显著增加(P<0.01),说明PGE2可抑制成骨细胞增殖,促进其分化。PGE2处理成骨细胞30 min时细胞的NF-κB和BMP-7蛋白表达与对照组比较即显著增加(P<0.01),Id2蛋白表达与对照组比较显著下降(P<0.01),细胞内NF-κB蛋白出现核转移和活力增加,说明PGE2可诱导成骨细胞内NF-κB的活化,BMP-7蛋白的表达增强,Id2蛋白表达下降。PGE2单独处理成骨细胞时细胞的凋亡率与正常组比较无显著差异(P>0.05),BAY11-7082和PGE2共同处理细胞后,细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率与正常对照组比较都有显著增高(P<0.01),且NF-κB、BMP-7蛋白表达与对照组比较显著下降(P<0.01),Id2蛋白表达与对照组比较显著增加(P<0.01),ALP活力较对照组显著下降(P<0.01),说明NF-κB抑制剂可显著抑制由PGE2诱导的细胞分化,与PGE2共同作用可引起细胞凋亡,并可显著抑制由PGE2诱导的成骨细胞内BMP-7和Id2蛋白表达的变化。3.体内实验中骨折未处理组3 d和7 d时骨痂组织的PGE2含量和ALP活力都较对照组显著增加(P<0.01), NF-κB、BMP-7蛋白表达较对照组显著增加(P<0.01),Id2蛋白表达较对照组显著下降(P<0.01),说明在正常骨折愈合过程中,PGE2含量和ALP活力增高,NF-κB、BMP-7蛋白表达升高,Id2蛋白表达下降。用BAY11-7082干预后,骨痂的PGE2含量和ALP活力都较对照组显著下降(P<0.01)。NF-κB、BMP-7蛋白表达较对照组显著下降(P<0.01),Id2蛋白表达较对照组显著增加(P<0.01)。组织学切片HE染色可见BAY11-7082处理组术后14 d时骨痂组织为软骨性骨痂,而骨折未处理组术后14d时骨痂组织的边缘处已经形成骨性骨痂,BAY11-7082处理组28 d时骨痂组织中开始出现骨性骨痂,而骨折未处理组28 d时骨痂组织中均为骨性骨痂。表明BAY11-7082可抑制体内骨折愈合过程中PGE2含量和ALP的活力,最终导致骨折延迟愈合。4.PGE2处理30 min后,成骨细胞基因表达谱中有276个基因表达上调,168个基因表达下调。与炎症、骨再生有关的PGE2诱导的上调基因有：monocyte to macrophage differentiation-associated (MMD)基因,即单核细胞向巨噬细胞转化基因；nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2基因,即NR4A2, NF-κB的活化是和NR4A2的启动子密切相联的,且NF-κB和NR4A2密切相连的位点正是p65-p50异源二聚体或p50同源二聚体；catenin(cadherin-associated protein),即钙粘蛋白,Wnt/β-catenin通路通常被称为Wnt通路,在骨再生过程中起重要作用；osteoblast specific factor (POSTN),即成骨细胞特异性因子；bone morphogenetic protein 7 (osteogenic protein 1),即BMP-7。与炎症、骨再生有关的PGE2诱导的上调基因有：Id1、Id2、Id3。结论：1.低浓度的LPS可诱导成骨细胞增殖。LPS诱导的成骨细胞增殖作用是通过NF-κB信号途径,而与COX-2的蛋白表达无关。我们推测在骨再生炎症反应的初始阶段,NF-κB信号途径起核心作用。2.PGE2可通过NF-κB信号途径来诱导BMP-7蛋白的高表达和Id2蛋白表达下降,从而引起成骨细胞分化,促进骨形成。BAY11-7082可抑制PGE2对成骨细胞的分化作用,共同作用于成骨细胞可引起细胞凋亡。NF-κB可调节骨折愈合过程中PGE2的产量。BAY11-7082可抑制骨折愈合过程中PGE2产量的增加,降低ALP活力,最终导致骨折延迟愈合。PGE2-NF-κB的相互调节作用在骨再生过程中是非常重要的信号传导途径。3.应用基因芯片技术研究PGE2对成骨细胞基因表达谱的影响,研究发现PGE2处理后成骨细胞促成骨的基因和核受体基因上调,Id蛋白家族表达下调,基本支持我们前两章的结论。因此,我们可以把NF-κB作为骨创伤修复过程中的一个重要靶点,开发其特异性干预剂,用于骨不连或骨延迟愈合的治疗中。