KCNQ离子通道基因突变与许多遗传疾病有关，目前发现共有KCNQ1-5五个亚型。其中KCNQ1与KCNE1共同编码组成心肌上的延迟整流钾离子通道，该通道的突变可以引起遗传性QT间期延长综合症，并可致耳聋。KCNQ2和 KCNQ3通道共表达产生的电流已经被证实是颈上交感神经节记录到的M电流分子基础。KCNQ2/3基因突变或M通道功能失调与良性家族性新生儿惊厥症、阿尔兹海默病和癫痫等疾病的发生密切相关。KCNQ2/3通道的开放剂瑞替加滨降低神经元兴奋性，可用于治疗与过度神经元兴奋相关的疾病，如惊厥、癫痫和神经性疼痛等。KCNQ4钾离子通道由于其基因突变导致人类耳聋耳鸣等疾病，已成为耳聋耳鸣防治药物的潜在靶点。因此，对KCNQ钾通道和Kir2.3钾通道靶点的调节剂研究有重要的潜在应用价值。　　 人们对钾离子通道的调节剂广泛需求促进了其高通量筛选技术的广泛发展，其低消耗，快速，灵敏，准确和高通量等特点更为适合我国的新药研发技术领域的需求。　　 一、钾离子通道调节剂高通量筛选技术平台的建立和优化　　 目的：在建立KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3钾离子通道稳定表达细胞系的基础上，建立和优化原子吸收Rb+流出测定高通量筛选技术，并完成近150多种化合物的筛选。　　 方法：(1)建立稳定表达Kir2.3通道蛋白的HEK293细胞株：用Lipofectin 2000转染试剂将Kir2.3通道基因转染到HEK293细胞，经G418筛选，用全细胞膜片钳技术检测Kir2.3通道蛋白在HEK293细胞中的功能。(2)建立和优化原子吸收Rb+流出测定高通量筛选技术：配制浓度梯度铷标准溶液和设置10个相同浓度铷标准溶液，测定ICR8000系统的准确度和灵敏度；配制KCl浓度梯度去极化缓冲液，观察其对Rb+外流的影响，寻求最佳胞外钾浓度；将稳定表达KCNQ2/3、KCNQ4和Kir2.3通道细胞接种于96孔培养板，给予含有待测化合物的去极化外液，观察其对Rb+外流的影响从而完成钾通道调节剂的筛选。　　 结果：(1)G418筛选培养14天形成阳性克隆。经全细胞膜片钳技术鉴定，该细胞系表达的Kir2.3通道电流具有内向整流特性。在高钾外液条件下翻转电位0mV，与等浓度高钾条件下由Nerst方程所得的钾平衡电位相符，并且Ba2+能够有效地抑制Kir2.3的电流。(2)①采用RbCl标准品，配制浓度梯度铷标准溶液，通过原子吸收测定仪ICR8000系统测量标准溶液吸收度，实验结果表明ICR8000系统灵敏度很高，达到ppm单位级；标准曲线相关系数R值可达0.999；重复测定10个标准溶液浓度标准差SD为3.66[％]，变异系数CV为3.46[％]，均小于5[％]。②含20 mM KCl去极化缓冲液可以刚刚引起Rb+小量外流，是最佳胞外钾浓度。③通过高通量筛选技术测得，对照药Retigabine可以明显增加细胞内Rb+外流，且EC50值在0.05-0.15 mM，与文献报导相符合(3)通过采用上述原子吸收Rb+流出测定的高通量筛选技术，我们已初步完成对近150种化合物的筛选。其中系列Ⅰ代表化合物QO-26、QO-28、QO-58和QO-60具有激活KCNQ2/3通道的作用，EC50值分别为2.27±1.02 mM、1.46±0.36 mM、0.06±0.01 mM和0.15±0.02 mM。系列Ⅱ代表化合物KG-1和KG-25 EC50值分别为3.8±0.36 mM和2.29±0.67 mM。系列Ⅲ代表化合物JM3和JM4 EC50值分别为1.67±0.89 mM和2.41±0.78 mM。(4)KCNQ4钾通道靶点的筛选方法与KCNQ2/3通道靶点的筛选方法相同。其中代表化合物QO-26和QO-28 EC50值分别为23.92±0.43mM和21.73±9.72 mM。(5)BaCl2明显抑制表达Kir2.3通道的细胞内铷离子的流出至未给药对照组的71.6[％]，与文献相符。100 mM QO-28和300 mM QO-28分别使表达Kir2.3通道的细胞的铷离子流出量减少至对照组的51.7[％]和增加至对照组的131.7[％]；30 mM QO-58和100 mM QO-58分别使铷离子流出量减少至对照组的75.5[％]和增加至对照组的131.9[％]。　　 结论：(1)成功建立起稳定表达Kir2.3钾通道HEK293细胞株。(2)成功建立以KCNQ2/3通道为靶点的高通量筛选平台，并完成近150种化合物的筛选，筛选出能够开放KCNQ2/3通道作用的三个系列具有创新性结构的，近38个化合物具有开放KCNQ2/3通道的作用，其中26个化合物是首次合成。(3)成功建立以KCNQ4通道为靶点的高通量筛选平台，完成对近100种化合物的筛选，筛选出14个具有开放KCNQ4通道作用的化合物，与开放KCNQ2/3通道的化合物相同。(4)成功建立以Kir2.3通道为靶点的高通量筛选平台，并发现QO-28和QO-58对Kir2.3通道作用为低浓度抑制高浓度开放。　　 二、利用膜片钳技术对高通量筛选所得钾通道开放剂的深入研究目的：进一步验证我们建立的高通量筛选方法是否成功，并选取代表化合物对其作用特征进行较为深入研究。　　 方法：利用电生理膜片钳技术，观察由高通量筛选所得钾通道开放剂对KCNQ2/3和KCNQ4通道电流的影响，并深入观察代表化合物QO-28和QO-58作用特征。　　 结果：(1)100 mM浓度的QO-26、100 mM浓度的QO-28、10 mM浓度的QO-58和10 mM浓度的QO-60号化合物都可以明显增大-40 mV电压下KCNQ2/3通道电流，激活通道电流幅度与10 mM RTG 相近。(2)10 mM浓度的QO-58、QO-60、KG-1和KG-5都可以明显增大-40 mV、-20 mV、0 mV电压下KCNQ4通道电流，增大电流幅度均高于10 mM RTG。(3)化合物QO-28对钾通道选择性的研究:①QO-28先增加后抑制KCNQ1钾通道电流，并使KCNQ1通道电流动力学特点由慢激活改变为快激活。②QO-28先增加后抑制Kir2.3钾通道电流。(4)化合物QO-58能够剂量依赖性增大KCNQ2/Q3电流，以-40mV电压下最大激活电流值为1标准化，用logistic方程对其进行拟合量效关系曲线得EC50=2.30±0.86 mM，斜率为0.60±0.14。(5)化合物QO-58能够剂量依赖性增大KCNQ4电流，以-40mV电压下最大激活电流值为1标准化，用logistic方程对其进行拟合量效关系曲线得EC50=0.60±0.09 mM，斜率为0.91±0.13。(6)QO-58能够将KCNQ2/Q3通道电压激活曲线向超极化方向移动，并呈浓度依赖性作用。10 mM QO-058能够将其半数最大激活电压 从给药前的-13.2±0.1 mV左移至-58.2±0.2 mV。(7)QO-58能够将KCNQ4通道电压激活曲线向超极化方向移动。10 mM QO-058将其半数最大激活电压 (V1/2)从给药前的-22.0±1.4 mV左移至-80.7±2.9 mV。(8)10 mM QO-058能够显著增强大鼠背根神经元中的M电流，其作用强度与10 mM 瑞替加滨相当，可引起通道电流增大25[％]。(9)100 mM QO-58可以引起KCNQ1/KCNE1通道电流增大1倍。　　 结论：(1)电生理膜片钳技术确证KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶点高通量筛选结果。(2)化合物QO-28对KCNQ1钾通道电流和Kir2.3钾通道电流具有先增加后抑制作用。(3)化合物QO-58呈剂量依赖性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道电流，其EC50值分别为2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。(4)化合物QO-58呈剂量依赖性使KCNQ2/3和KCNQ4通道电压依赖性激活向超极化方向移动。(5)化合物QO-58能够增大大鼠背根神经元中的M电流。(6)化合物QO-58能够增大KCNQ1/KCNE1通道电流。　　 总结：　　 1.成功建立起稳定表达Kir2.3钾通道HEK293细胞株。　　 2.成功建立以KCNQ2/3通道为靶点的高通量筛选平台，并完成近150种化合物的筛选，筛选出能够开放KCNQ2/3通道作用的三个系列具有创新性结构的，近38个化合物具有开放KCNQ2/3通道的作用，其中26个化合物是首次合成。　　 3.成功建立以KCNQ4通道为靶点的高通量筛选平台，完成对近100种化合物的筛选，筛选出14个具有开放KCNQ4通道作用的化合物，与开放KCNQ2/3通道的化合物相同。　　 4.成功建立以Kir2.3通道为靶点的高通量筛选平台，并发现QO-28和QO-58对Kir2.3通道作用为低浓度抑制高浓度开放。　　 5.电生理膜片钳技术确证KCNQ2/3通道和KCNQ4通道靶点高通量筛选结果。　　 6.化合物QO-28对KCNQ1钾通道电流和Kir2.3钾通道电流具有先增加后抑制作用。　　 7.化合物QO-58呈剂量依赖性增大KCNQ2/Q3通道和KCNQ4通道电流，其EC50值分别为2.30±0.86 mM和0.60±0.09 mM。　　 8.化合物QO-58呈剂量依赖性使KCNQ2/3和KCNQ4通道电压依赖性激活向超极化方向移动。　　 9.化合物QO-58能够增大大鼠背根神经元中的M电流。　　 10.化合物QO-58能够增大KCNQ1/KCNE1通道电流。