在肾内髓质中RXRα与OREBP相互作用对渗透压调节的影响与机制研究

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目的:渗透应激调控转录因子OREBP(osmotic response element binding protein)可参与调节与渗透压有关的基因。在高渗环境中OREBP可调节其下游与渗透相关的靶基因的表达,使有机大分子物质和热休克蛋白大量聚集在细胞中,维持细胞正常的形态和生理功能。维甲酸X受体α(retinoid X receptorα,RXRα)可与多种核受体形成异源二聚体调节基因的表达,但它与OREBP的相互作用及其对机体渗透压的影响迄今为止还不清楚。本研究从体外和体内两个方面来研究在肾内髓质中 RXRα与OREBP的相互作用对渗透压的调节作用,并深入探讨这一作用的机制。  方法:(1)在体外培养的mIMCD3细胞中,改变NaCl的作用时间和作用浓度,用Western Blot和Real-Time PCR来检测渗透压改变对RXRα表达水平的影响。(2)通过转染RXRα的过表达质粒或干涉质粒来改变mIMCD3细胞中RXRα的表达,用萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒和染色质免疫共沉淀技术检测RXRα对OREBP转录活性及其靶基因的影响;用免疫共沉淀技术检测RXRα蛋白和OREBP蛋白间的关系。(3)将6-8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为三组:正常组、禁水组和呋塞米组,用IHC、Western Blot和Real-Time PCR检测不同条件下小鼠肾髓质中RXRα的表达水平;用Real-Time PCR检测小鼠体内环境的改变对肾髓质中OREBP及其下游渗透靶基因NET、TauT、Hsp70和AR mRNA表达的影响。(4)给6-8周龄C57BL/6雄性小鼠的肾脏直接注射慢病毒介导的RXRα,特异性的增加小鼠肾脏中RXRα的表达,对小鼠肾脏进行组织切片和H&E染色,研究RXRα过表达对小鼠肾髓质的形态学影响;用IHC检测肾髓质中RXRα、Hsp70和AR的蛋白表达;同时,用Real-Time PCR检测小鼠肾髓质中OREBP下游渗透靶基因NET、TauT、Hsp70和AR的mRNA表达。  结果:(1)在mIMCD3细胞中,渗透压条件的改变会影响RXRα的表达。在高渗条件下,随着NaCl作用时间的延长RXRα的表达逐渐降低;NaCl作用8 h后,RXRα的表达降到最低。此外,RXRα的表达也随着渗透压浓度的改变发生改变,即随着渗透浓度的增加RXRα的表达水平会逐渐降低。(2)RXRα过表达会降低OREBP的转录活性及其靶基因的表达,而抑制RXRα的表达OREBP的转录活性及其靶基因的表达均有所增加;无论在高渗还是等渗环境中过表达或干涉RXRα都不会影响OREBP的表达;RXRα与OREBP在结构上相互作用,从而阻止OREBP与其靶基因启动子结合,进而影响OREBP对渗透压的调节。(3)在小鼠肾髓质中RXRα的表达会随着小鼠体内渗透压环境的改变而改变,而 OREBP及其下游渗透压相关靶基因 mRNA的表达则随着渗透压的升高而升高。(4)过表达RXRα会改变小鼠肾髓质的形态学结构;此外,RXRα过表达会抑制小鼠肾髓质中OREBP下游渗透压相关靶基因的表达。  结论:RXRα在结构上与OREBP相互作用,从而抑制OREBP与其渗透相关靶基因结合,对维持肾脏的正常形态和渗透调节功能起重要作用。
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