原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,位居全球肿瘤发病率第六位,致死率高居第三位。而我国更是肝癌高发区,肝癌死亡率占恶性肿瘤死因的第二位。因此寻找对正常细胞毒性较低的高效多靶点的抗癌药物刻不容缓。氧化阿朴菲生物碱是一类天然产物,且其大多化合物均具有较好的抗菌、抗肿瘤、抗氧化活性以及其他较特殊的作用机制,具有良好的药用前景。本课题组率先开展并致力于氧化阿朴菲类金属配合物合成与研究已达十年之久,取得了一定的成就,但是对其抗肿瘤机制还是知之甚少。因此,还需继续深入研究其抗肿瘤机制。本论文内容包括:1、介绍了细胞周期S期阻滞和细胞凋亡死亡受体凋亡路径的发现及研究进展,以及细胞周期、细胞凋亡与细胞自噬的关联。并在此基础上阐述选题意义和研究思路。2、通过MTT法和CCK8法测试并验证了 4个9-羟基-2-异丙氧基-1,10-二甲氧基-7-氧化阿朴菲过渡金属配合物（OD-Ru（Ⅱ）配合物1,OD-Rh（Ⅲ）配合物2,OD-Ni（Ⅱ）配合物3,OD-Zn（Ⅱ）配合物4）和1个9-乙酰葡萄糖酯-2-异丙氧基-1,10-二甲氧基-7-氧化阿朴菲过渡金属配合物（OD-G-Zn（Ⅱ）配合物5）及其相应的金属盐对MGC80-3人胃癌细胞、BEL-7404人肝癌细胞、NCI-H460人肺癌细胞、Hep-G2人肝癌细胞、MG-63人成骨肉瘤细胞、HL-7702人正常肝细胞等细胞株的体外增殖抑制活性。结果显示:配合物1、2、3、4、5均对Hep-G2人肝癌细胞表现了较高的抑制活性。接着通过流式细胞术对其周期和凋亡进行检测,实验结果表明,配合物3、4、5与Hep-G2细胞作用后,配合物3和4在低浓度下可将Hep-G2细胞明显阻滞在S期。配合物5则能诱导Hep-G2细胞出现明显凋亡现象,凋亡率与药物浓度呈现依赖性关系。3、Hoechst 33258和DID双染法检测药物作用24小时后细胞的形态变化,实验结果证实:配合物3、4不能诱导细胞产生凋亡;而配合物5作用后的细胞,膜与核均发生较大变化。同时应用流式细胞术检测药物对相关caspase蛋白的激活情况,其中配合物3、4能激活细胞内的Caspase3,却不能激活Caspase8和Caspase9;配合物5能使细胞内Caspase3、Caspase8、Caspase9大量激活。上述实验结果表明,配合物3、4不能诱导细胞发生Caspase依赖性细胞凋亡;而配合物5可能通过死亡受体通路诱导细胞发生凋亡。4、用流式细胞术检测Hep-G2细胞内的ROS水平和Ca2+浓度情况,结果显示:随着配合物3和4作用浓度的增大,可使细胞内ROS水平和Ca2+浓度均先增后减,配合物5作用后的细胞内ROS水平和Ca2+浓度都不断增大。配合物3和配合物4是同配体的Ni（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）配合物,其细胞内ROS水平和Ca2+浓度的变化相似;而配合物5和配合物4是不同配体的Zn（Ⅱ）配合物,它们所诱导的细胞内ROS水平和Ca2+浓度变化规律不一样。利用激光共聚焦显微镜检测细胞内自噬标志性蛋白LC3B的表达情况,发现配合物3、4、5均能引起Hep-G2细胞发生自噬,但自噬程度不同。初步确定配合物3、4能引起细胞内适度自噬,使细胞产生自身保护能力;配合物5引起细胞发生自噬过度,最终导致细胞自噬性死亡。上述实验结果表明,配合物3、4能引起细胞内自身保护性自噬;而配合物5则引起细胞发生凋亡和自噬性死亡。5、用ICP-MS实验检测配合物在细胞内分布,结果显示:配合物3、4主要进入细胞核内对细胞产生作用;配合物5主要进入细胞膜内对细胞产生作用。运用RT-PCR和Western Blot方法检测,配合物3和4使Hep-G2细胞的表皮生长因子受体EGFR受激,将信号传导至下游系列因子,最终阻滞细胞周期。与细胞周期S期相关的Akt总量不变,p21、p27表达量上升,p-Akt、PCNA、CDK2、Cdc25A、c-myc、CyclinA2、CyclinE1 表达量下降。这一结果表明:细胞周期S期阻滞与Akt-p27-CDK2、Akt-CyclinD-CDK2和c-myc-Cdc25A-CDK2、c-myc-p21-CyclinE1-CDK2 密切相关;被配合物 5 作用后,Hep-G2细胞内的凋亡因子和自噬特征蛋白,如:Fas、Caspase 8、Caspase 3、PARP、LC3B、Beclin1表达量上升。表明配合物5通过死亡受体通路来诱导细胞凋亡,同时引起细胞自噬性死亡。综上所述,化学结构不同的配合物3、4、5,因为构效关系不同,使其抗肿瘤机制存在着较大差别。1、配合物3、4（9-羟基-2-异丙氧基-1,10-二甲氧基-7-氧化阿朴菲Zn、Ni配合物）抗Hep-G2肝癌的主要潜在机制是:通过刺激Hep-G2细胞的生长因子受体EGFR,最终将细胞阻滞于细胞周期S期。2、配合物5（9-乙酰葡萄糖酯-2-异丙氧基-1,10-二甲氧基-7-氧化阿朴菲）抗Hep-G2肝癌潜在机制是多方面的:（1）通过将Hep-G2细胞部分阻滞在细胞周期S期来协同调控其抗肿瘤机制。（2）刺激Hep-G2细胞,使细胞内ROS水平升高,诱导细胞发生过度自噬,引起细胞自噬性死亡。（3）刺激Hep-G2细胞的膜死亡受体因子Fas,激活死亡受体介导的凋亡启动因子Caspase 8,从而进一步激活下游的执行因子Caspase 3,并切割底物PARP,启动死亡受体途径来诱导细胞凋亡。