背景:随着经济社会的高速发展,大气污染已成为整个人类社会面临的紧迫问题。早在上世纪发达国家的城市化和工业化进程中,人们已逐渐认识到大气污染对生命健康带来的危害,中国目前正处于经济高速发展及城市化快速进程中,发达国家在不同工业发展阶段所经历的大气污染问题,在我国以压缩共存的方式集中显现,具有PM2.5浓度超标严重、持续时间长且涉及区域广的特点。PM成分复杂,主要由矿物粉尘、元素碳、氮氧化物、SO2、CO和有机物质组成,其有机成分中对人体危害最大的是多环芳烃及其衍生物,这些细颗粒物不易被上呼吸道粘膜纤毛系统清除,极易沉积到肺泡和下呼吸道中,当吸入的颗粒物超过机体的清除能力时,引发氧化应激、炎症反应、DNA断裂损伤等一系列反应,导致局部的肺损伤,超细颗粒物甚至能够穿透肺部进入血液循环,对整个机体健康带来威胁,目前已明确PM2.5暴露与许多健康效应相关,如住院率和急诊率的增加,呼吸道症状,慢性呼吸道和心血管疾病的加重,肺功能下降和过早死亡等。因此,对PM2.5暴露的监测、风险评价及其健康效应的研究日益重要,通过代谢组学技术测定生物标志物获知机体在PM2.5暴露过程中发生的生物学变化,为环境风险评价提供生物学指标,有助于从整体角度探讨PM2.5暴露对人体健康效应的影响。PM2.5是霾的重要组成部分,中医对雾霾早有认识,提出雾霾为有形之邪,本身具有一定毒性,可通过口鼻侵入机体,大量的颗粒成分又能吸附毒素,停留在肺部深处,阻滞气机,损伤肺络,肺不化气,津液不通,内生痰饮。从中医角度讲,雾霾兼毒燥湿三气,雾霾致病以邪盛正虚为发病基础,以毒火痰瘀四物为病机关键,以肺脉痹阻与肺叶痿废为疾病结局;治疗上宜辨清邪正关系,根据病情及病势的不同,分期予驱邪扶正之大法。我科经过长期临床实践及观察总结,提出雾霾为阴浊之邪,致病具有“闭、塞、遏”的特点,因此,防霾治霾重在“宣、通、化。”基于上述理论基础,我科从宣肺化浊法立论,在清代医家张锡纯理饮汤的基础上创制防霾的有效方剂“清肺降霾方”,该方以宣肺化浊为基本治则,达到清肺毒而防霾的目的,临床上将清肺降霾方投用于那些自述与雾霾天气相关的肺系疾病患者多有良效。因此,本研究拟通过代谢组学技术和网络药理学方法联合探讨清肺降霾方防治PM2.5的作用机制,为后续进一步研究提供方向与基础。目的:1.基于高效液相色谱-高分辨质谱联用技术的代谢组学平台,对健康人PM2.5暴露前后的尿液进行代谢组学分析,筛选差异代谢物,并进行KEGG富集分析、ROC分析、时间序列分析,观察这些差异代谢物在短期暴露-净化循环中的变化,从动态角度观察PM2.5对人体健康的影响。2.基于网络药理学的方法,结合上述代谢组学KEGG富集分析的代谢通路结果,构建药物-靶点-疾病-通路的网络系统,探讨清肺降霾方防治PM2.5相关肺损伤的作用机制。方法:（1）临床研究:①采用自身前后对照的设计方法,纳入50名健康受试者作为研究对象。②在任意一个清洁天气条件下（PM2.5≤75 ug/m3或AQI≤100）留取受试者的晨尿作为基线样本,为避免干扰,要求采样前三天同样为清洁天气。③选择任意一个污染天气（PM2.5>115 ug/m3或AQI>150）,受试者晨起空腹至实验地点（8:00）、佩戴FreeAir设备4小时（8:00-12:00）,然后摘掉FreeAir设备再次自然暴露3小时（12:00-15:00）,最后佩戴FreeAir设备4小时（15:00-19:00）,通过FreeAir设备的干预,交叉暴露于污染空气与净化空气中。为排除饮食干扰,试验当天所有受试者按需使用雅培全安素（200g每个时间点=900KJ）及屈臣氏蒸馏水。（2）代谢组学研究①数据采集及处理:采用超高效液质联用分析平台对样本进行全扫描检测,采集原始数据并对数据进行预处理;②使用 The Human Metabolome Database（HMDB）及 METLIN 数据库进行代谢物定性分析;③通过多元统计分析及单变量统计分析结合试验设计进行差异代谢物的筛选,并进行KEGG富集分析,时间序列分析及ROC分析。（3）网络药理学研究①通过TCMSP平台获得清肺降霾方的活性成分及作用靶点,通过GeneCards等数据库获取PM2.5相关肺损伤的疾病靶点,取药物靶点和疾病靶点的交集,获得交集靶点。②通过Cytoscape平台,构建活性成分-靶点网络,利用STRING平台绘制PPI网络,使用DAVID数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析。③基于代谢组学的研究结果,筛选出二者共有的代谢通路,利用上述收集到的活性成分,靶点、结合共有的代谢通路,构建药物-靶点-疾病-通路的网络系统。④根据上述网络系统,对清肺降霾方防治PM2.5相关肺损伤的潜在活性成分和靶点加以预测,并进行分子对接验证,为后续进一步研究提供基础与方向。结果:（1）临床研究:根据受试者的纳入与排除标准,本研究共纳入50例不吸烟的健康受试者,最终42例受试者（22女性和20男性）完成本试验,8例受试者因未完成样本收集而脱落,试验期间所有受试者无明显不适。（2）代谢组学研究结果①通过非靶向LC-MS获得了 42例健康受试者5个时间点的短期PM2.5暴露前后的尿液代谢谱,确定了 31个与PM2.5暴露相关的差异代谢物,与氧化应激、炎症反应、基因表观遗传密切相关,其中,鞘氨醇（Sphinganine）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、单异丁基邻苯二甲酸（Monoisobutyl phthalic acid）、邻苯二甲酸（Phthalic acid）、还原尿睾酮（Etiocholanolone）、16-脱氢孕酮（16-Dehydroprogesterone）、7-甲基鸟嘌呤（7-Methylguanine）和 1-甲基腺苷（1-Methyladenosine）可作为监测室外短暂空气污染对人体代谢干扰的指标,以及诊断PM2.5相关疾病的生物标志物。②KEGG富集分析共获得31条代谢通路,其中5条代谢通路较为显著（p<0.05）:鞘脂信号通路、鞘脂代谢通路、吗啡成瘾通路、酒精中毒通路和嘌呤代谢通路。（3）网络药理学研究结果①通过TCMSP平台共获得清肺降霾方159个活性成分及2606个活性成分作用靶点,通过GeneCards等数据库获取2288个PM2.5相关肺损伤的疾病靶点,对药物靶点和疾病靶点取交集,获得127个交集靶点。②通过Cytoscape平台,使用交集靶点构建活性成分-靶点网络,根据度值（degree）获得排名靠前的活性成分quercetin、beta-sitosterol;利用STRING平台绘制PPI网络,将数据导入Cytoscape软件进行拓扑分析及可视化,获得排名靠前基因JUN、MAPK1等,使用DAVID数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析。③结合代谢组学的研究结果,筛选出13条共有代谢通路,利用上述过程收集到的活性成分、靶点、以及共有代谢通路,构建药物-靶点-疾病-通路的网络系统。④预测清肺降霾方的活性成分为槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）,二者具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用,潜在作用靶点为MAPK1、JUN,进行分子对接验证后表明成分与靶点结合能较好;相关研究表明,β-谷甾醇可通过抑制表皮细胞、巨噬细胞中炎症小体NLRP3的激活,来抑制CAS1的产生及MAPK信号通路的活化,使细胞中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8生成显著减少从而起到抗炎作用,综上,清肺降霾方防治PM2.5相关肺损伤的有效性可能与β-谷甾醇抑制MAPK信号通路的活化密切相关。结论:（1）非靶向代谢组学结果显示,短期PM2.5暴露可对健康人带来负面影响,主要与氧化应激、炎症反应、基因表观遗传有关。（2）通过结合非靶向代谢组学分析结果及构建“药物-成分-靶点-疾病-信号通路”网络,从整体看,清肺降霾方通过槲皮素、β-谷甾醇等主要活性成分发挥抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用,具体机制上,清肺降霾方防治PM2.5相关肺损伤的有效性可能与β-谷甾醇抑制MAPK信号通路的活化密切相关。