研究目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因未明的慢性肠道免疫性疾病。一般认为IBD的发生是环境因素作用于遗传易感者,在肠道菌群的参与下,启动了肠道免疫及非免疫系统,最终导致自身免疫性炎症反应。其中,IBD的自身免疫性特点与T细胞免疫应答密切相关,特别是肠道粘膜上Th细胞亚群失衡。因此,从调节T细胞亚群失衡角度,尤其是Th细胞亚群,深入了解IBD多因素多靶点的发病机制,对进一步阐明IBD的免疫发生机制有重要意义。广藿香是治疗暑湿蕴结诱发的胃肠疾患的岭南道地药材,具芳香化浊、开胃止呕、发表解暑的功效。广藿香酮(Pogostone, PO)是广藿香的主要有效成分。本课题组前期研究证实,广藿香的挥发油成分可明显缓解三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)诱导的IBD症状。因此,本论文拟从调节T细胞亚群平衡角度,观察广藿香酮对IBD的治疗作用,并对其作用机制进行初步探讨,不仅有助于进一步认识IBD的免疫发生机制,更为科学阐释广藿香药效物质基础的科学内涵提供依据。方法1.广藿香酮对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD的治疗作用1)取雄性SD大鼠,设正常组(Normal),模型组(Model),柳氮磺吡啶组(SASP,200mg/Kg),广藿香酮组(PO,20,40,80mg/Kg)。除Normal组外,其余各组通过直肠灌注TNBS(25mg/Kg)制备IBD模型。从造模当天开始,各组动物连续7天灌肠给予相应药物,正常组及模型组给予等体积药物溶剂；2)以体重变化、粪便性状、血便/便血情况建立疾病活动指数(Disease Activity Index, DAI)评分体系,评价动物。于实验第8天,剖取各组大鼠肛门至盲肠段结肠,对大鼠结肠组织炎症作大体评分(Macroscopic score, MS).结合DAI和MS评分结果,在PO实验组中选择效果最优剂量组的样品进行以下实验；3)所得结肠的病变部位(距肛门端约8cm),部分通过苏木素/伊红(hematoxylin-Eosin, H&E)染色法,进行病理组织学评分(histological score, HS),同时通过免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)检测,分析CD4、叉头框蛋白P3(Foxp3)、IFN-γ、IL-17表达情况。此外,部分组织用于检测组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO)活性变化；应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测组织中转化生长因子-β(TGF-β)含量,同时应用液态悬浮芯片技术检测组织中白介素-17A(IL-17A), IL-10, IL-4, IL-12p70, γ-干扰素(IFN-γ)含量；4)应用流式细胞术检测大鼠肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)中辅助性T细胞(helper T cell, Th)中 IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3表达率,分析Th1、Th2、Th17,以及调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)-比例；同时检测其中的Ki67、CD38/MHC Ⅱ表达率,以分析MLN中Th细胞的增殖和激活状态；5)应用荧光定量聚合酶链式反应技术(quantitative Realtime Polymerase Chain Reaction, quantitative rt-PCR),分析结肠组织和MLN中转录因子(Transcript fator, TF)T-bet, STAT1、GATA3、STAT6、STAT3、RORγt、Foxp3的mRNA相对表达量。2.广藿香酮对刀豆蛋白A(Concanavalin A, ConA)诱导的T细胞增殖的抑制作用1)广藿香酮与未刺激的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞共孵育48h和72h后,应用MTS细胞增殖试剂盒测定脾细胞的相对存活率,分析广藿香酮(5-80μM)的安全浓度；2)以终浓度为1 μg/mL的ConA为刺激剂建立T细胞增殖模型,以广藿香酮(20,40,80μM)干预72h。应用流式细胞术,以Anti-CD3、Anti-CD4、Anti-CD8抗体标记T细胞、CFSE标记法分析受刺激T细胞及其亚群的增殖情况：以Annexin V标记法分析受刺激T细胞的凋亡情况；以Annexin V/碘化吡啶(PI)双标记法分析其周期分布情况。此外,以Anti-CD3抗体标记T细胞,通过胞内蛋白标记法分析ConA刺激后T细胞中CDK2、CyclinE、CDK1、Cyclin B的表达情况；3)以流式微球阵列分析法(Cytometry Beads Array, CB A)分析细胞上清液中IL-6, IL-10,单细胞趋化因子蛋白-1 (Monocyte chemotactic protein, MCP-1), IFN-y,以及肿瘤坏死因子(Tumor nerosis factor, TNF)的分泌。结果1.广藿香酮对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导IBD的治疗作用1)在25mg/KgTNBS刺激下,模型组大鼠与正常组相比,出现体重明显下降、稀便、血便等典型的IBD体征,伴有明显的肠粘连、溃疡／坏死严重、肠壁水肿增厚明显等结肠病变。HE染色显示模型组大鼠结肠黏膜出现明显的透壁性炎症,包括溃疡、隐窝变型,黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润,肌层肥大增厚,伴有血管增生。组织中MPO活性明显升高进一步说明了模型组结肠组织出现严重的炎症浸润。相比之下,广藿香酮可明显提高IBD模型动物的生存质量,使其粪便性状逐渐恢复正常,并防止血便发生,DAI评分明显低于模型组；同时,广藿香酮组(40mg/Kg)的MS和HS均明显低于Model组,广藿香酮可减轻结肠水肿、溃疡、坏死,降低组织中MPO活性,其中广藿香酮(40mg/Kg)效果最优。HE染色结果表明广藿香酮(40mg/Kg)可促进结肠黏膜愈合,减少溃疡面积,促进隐窝形态恢复正常,减少炎性细胞浸润,使肌层变薄,说明广藿香酮可有效缓解IBD的肠道炎症反应。细胞因子谱分析结果表明,模型组大鼠结肠组织中IL-4、IL-12p70、IL-10、IL-17、TGF-β含量明显高于正常组,而广藿香酮(40mg/Kg)则可抑制IFN-γ、IL-12p70、 IL-17、IL-10的分泌。此外,免疫组化分析结果表明,模型组大鼠结肠组织中CD4、IFN-γ、IL-17、Foxp3的表达明显高于正常组,提示模型组大鼠结肠组织出现明显的Th细胞浸润；与此相比,广藿香酮(40mg/Kg)可明显抑制组织中CD4、IFN-γ、IL-17的表达,减少Th细胞,尤其是Th1、Thl7细胞在病变黏膜中的浸润。Th细胞转录因子mRNA相对表达量分析表明,模型组动物组织中T-bet、GATA3、STAT6、Foxp3的相对表达量明显高于正常组,RORyt的表达量则明显低于正常组；而广藿香酮(40mg/Kg)对IBD模型动物组织中相应转录因子的mRNA相对表达影响较小,仅使RORyt明显提高至接近正常组。2)针对MLN的分析表明,模型组大鼠MLN中Th细胞的Ki67阳性率、CD38/MHC-Ⅱ共阳性率与正常组比较无明显差别,广藿香酮(40mg/Kg)对此也无明显影响；同时,模型组大鼠MLN中Th细胞的IFN-γ、IL-17、Foxp3表达率与正常组比较无明显差异,而IL-4表达率则明显升高；而广藿香酮(40mg/Kg)对MLN中Th细胞的IFN-γ、IL-4、IL-17、Foxp3的表达率无明显影响。针对MLN中Th细胞转录因子的mRNA相对表达量分析结果表明,与正常组比较,模型组大鼠MLN中GATA3表达明显下调的同时RORyt明显上升,而T-bet、STAT6、 STAT3、Foxp3则无明显变化；广藿香酮(40mg/Kg)使上述转录因子的mRNA表达恢复至接近正常组水平,其中使Foxp3的相对表达量与模型组有统计学差异。结果提示在本条件下,IBD模型动物MLN中Th细胞的激活、增殖状态,及各亚群的分化状态无明显变化,广藿香酮(40mg/Kg)对MLN中Th的上述指标也无明显影响。2.广藿香酮对刀豆蛋白A诱导的T细胞增殖的抑制作用1)结果表明,0-80μM广藿香酮对正常脾细胞的相对活力无影响,说明广藿香酮在该浓度范围内对淋巴细胞无毒性作用。在ConA诱导T细胞增殖模型中,由于“激活诱导的细胞死亡(AICD, Activation Induced Cell Death)"效应的存在,脾淋巴细胞出现了轻微凋亡,同时T细胞的增殖比例,及其在脾淋巴细胞中的比例明显升高。而广藿香酮(20,40,80μM)在不引起细胞毒性或凋亡的情况下,可明显降低T细胞的增殖比例及其细胞比例,说明广藿香酮可直接抑制ConA诱导的T细胞增殖,且进一步分析表明PO对Th中的CD4+T细胞和CD8+T细胞同样有直接增殖抑制作用。2)细胞周期分析结果表明,广藿香酮直接的增殖抑制活性可能与其诱导周期阻滞作用有关。ConA刺激后,处于S期和G2/M期的淋巴细胞比例明显增加,且进一步分析表明与S期的周期调控蛋白CDK2表达明显下降,而cyclin E,以及与G2/M相关的CDK1、cyclinB均明显增加。相比之下,广藿香酮(20,40,80μM)使S期和G2/M期的T细胞比例明显下降,同时明显减少cyclin E、CDKl、 cyclinB的表达。上述结果提示,广藿香酮可通过抑制增殖细胞中CDKl和CyclinB的表达,阻碍G2/M期检查点行使功能,从而使已处于增殖状态下的T细胞无法进入G2/M期,发生S期停滞,最终直接抑制了T细胞增殖。3)此外,细胞因子谱分析表明,ConA刺激可使脾淋巴细胞的IL-6、IL-10、 MCP-1、IFN-γ、TNF的分泌量显著增加,而广藿香酮(20,40,80μM)则可明显抑制其中的促炎因子IFN-y和抗炎因子IL-10的分泌。结论广藿香酮可明显改善IBD模型动物的生存质量,缓解IBD的肠道炎症反应,减轻结肠水肿、溃疡、坏死,减少病变黏膜中炎症细胞浸润,促进黏膜愈合,说明广藿香酮对IBD具有一定的治疗作用。体外实验结果进一步提示,广藿香酮的对IBD的治疗作用可能与其直接的免疫抑制作用有关。广藿香酮可通过诱导处于增殖状态的T细胞发生S期阻滞,对T细胞产生直接的增殖抑制作用,减少致炎性Th细胞Th1、Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病变黏膜中的浸润,从而减少促炎因子和抗炎因子的分泌,调节细胞因子网络平衡,最终钝化适应性免疫应答,全面抑制IBD发展过程中的攻击性免疫反应。上述实验结果提示,广藿香的特征性成分广藿香酮对实验性IBD模型具有明显的治疗作用,该作用与其直接抑制T细胞增殖、缓解IBD活动期间适应性炎症反应密切相关,提示广藿香在IBD治疗中有潜在的应用价值。