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背景 我国胃癌死亡率居各类癌症之首，是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤。目前，胃癌常规疗法效果不佳，由于缺乏胃癌特异性抗原，尚未研制出一种有效的疫苗用于胃癌免疫治疗。胃癌MG7-Ag是我实验室发现的较好的胃癌标志物，其抗原决定簇位于糖链上，属于碳水化合物抗原。我们应用噬菌体文库显示技术筛选得到了胃癌MG7-Ag的模拟表位多肽，抗体竞争结合试验证实该多肽具有良好的模拟原始抗原的能力。模拟表位多肽的确定为研制胃癌特异性疫苗奠定了基础。减毒沙门氏菌口服免疫后，可形成自限性感染，获得相应粘膜的局部免疫、体液免疫和细胞免疫。此外，该类疫苗具有安全、高效、简便和经济等优点。将MG7-Ag基因与HBcAg基因重组后转化S.typhimurium，通过口服免疫诱导特异性的粘膜、体液免疫和细胞免疫，有可能成为胃癌免疫治疗的一种有效途径。本实验采用作为口服疫苗载体的具有致死性平衡系统的减毒鼠伤寒杆菌，建立了能表达异源MG7-Ag基因的转化菌株，可引起抗胃癌的免疫反应。 目的 以减毒鼠伤寒沙门氏菌为疫苗载体，构建基于胃癌MG7-Ag模拟表位的口服活菌疫苗，观察其口服免疫Balb／c小鼠后诱导的体液和细胞免疫反应。 方法将Nco Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点、MG7-Ag模拟表位和HBcAg编 第四军医大学硕士学位论文 码序列的反向互补序列顺次设计于上游引物中，通过聚合酶链式反应将2 种表位相连接。将目的基因插入pUCm1载体，酶切鉴定和序列测定证实 后，利用pUCm＊载体和pYA3341载体共有的Nco和Hind Ill酶切位点， 经酶切鉴定和序列测定证实后，亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补o 的质粒pYA3341中，以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550，构建日服 鼠伤寒杆菌疫苗。用构建的口服鼠伤寒杆菌疫苗口服免疫Balb／c ，J’鼠，每 隔Z周加强免疫一次。以P＊S和携带pYA3341空载体的减毒鼠伤寒沙门 氏菌代替日服疫苗接种小鼠作为对照。观察小鼠对疫苗的耐受情况。初次 口服接种5石周后应用ELISA法检测小鼠血清中抗MG7叭g抗体的滴度。 初次免疫后8周时，取免疫鼠的脾细胞，以’℃r释放法检测小鼠脾淋巴细 胞对靶细胞的杀伤效果，反映细胞免疫反应情况。初次免疫8周后，用表 达MG7－Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞进行肿瘤攻击实验，观察疫苗对小鼠的 保护作用。 结果 经过PCR扩增出约600hp大小的片段，与目的基因大小相符， 测序结果表明：PCR产物为载体片段、Nco和Hnd Ill酶切位点、MG7－Ag 模拟表位及HBCAg的融合片段c将目的基因亚克隆入pYA3341，基因后测 序证实得到胃癌MG7叭g模拟表位与HBCAg的融合基因片段。最终得到 含有目的基因片段的重组表达载体pYA3341。重组质粒在X4550中的表 达产物，经 Western blot表明，在相对分子质量（Mr哟在22 000处有 1条 可与抗MG7hab特异性结合的多肽表位。口服疫茵免疫小鼠后疫苗免疫t 组小鼠血清抗MG7－Ag抗体较PBS和空载体对照组显著增高。各组小鼠 脾淋巴细胞体外杀伤实验未见显著差异。小鼠艾氏腹水瘤的攻击实验显 示：疫苗免疫组中5只小鼠有1只未见肿瘤形成，而对照组小鼠则全部成 瘤。 结论 成功研制可表达胃癌MG7人g模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗， －5－ 第四军医大学硕士学位论文 为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。以胃癌MG7Ag 模拟表位为基础的曰服减毒鼠伤寒沙l”刁氏菌疫苗具有免疫原性，可以诱导 个鼠产生显著的体液免疫反应，虽然MG7叭g模拟表位多肽刺激小鼠脾细 胞的增殖实验各组未见差异，但肿瘤攻击实验表明胃癌MG7叭g模拟表位｝曰服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗可以保护部分小鼠免受肿瘤攻击，提示可能 存在细胞免疫反应。实验表明：利用模拟表位构建减毒鼠伤寒沙门氏菌疫 苗是可行的；减毒鼠伤寒沙门氏菌是一种良好的疫苗载体；以胃癌 uo人叭g模拟表位为基础构建的口服鼠伤寒杆菌疫苗可以诱导抗肿瘤免 疫反亡，并可能具有部分保护作用。