亲和层析技术是对重组蛋白分离纯化的有效手段之一,具有易操作、纯化效率高等特点,但是亲和层析技术通常需要在目的蛋白中引入特殊的亲和标签。工业上常用的去标签手段有内切酶法、化学法等,但处理手段往往耗时耗力且十分昂贵。内含肽作为一种特殊的蛋白质,包含了IN、IC两个互不连续的蛋白片段。内含肽通过一系列重排、转酯、环化等自我催化的反应过程,可以从前体蛋白中切除并将两端的蛋白多肽链（蛋白质外显肽,Extein）通过一个天然的肽键连接,即通过蛋白质自我剪接作用实现蛋白质结构的重新布局。以此作为基础,将IN和IC片段分别设计为亲和配体和标签,借助两者的亲和作用完成蛋白纯化,再通过内含肽的自我剪切作用去除标签,有效的避免了标签对蛋白的影响,简化了蛋白纯化的操作。在实际应用过程中发现,基于Cfa Dna E内含肽制备的亲和层析介质纯化蛋白能得到较高的纯度,但是该新型介质的再生率较低,重复使用能力较差,本研究以该内含肽为研究对象,以分子对接结果为指导,结合蛋白质工程对Cfa Dna E内含肽进行改造,得出介质的最优再生条件。本研究成功构建了新的IC蛋白,在对识别连接、介质载量等方面没有明显影响的情况下,有效地提升了洗脱效果。具体研究内容如下:（1）研究Cfa Dna E内含肽IN的蛋白结构。需要根据IN的碱基序列建立IN蛋白模型,并进行分子动力学模拟,根据RMSF值分析IN蛋白中的柔性区域,结合蛋白质工程,对IN的部分蛋白进行改造。（2）预测突变对IN蛋白稳定性的影响。根据IN蛋白结构对模型进行突变,得到单突变、双突变和三突变的IN蛋白模型。对突变蛋白模型进行分子动力学模拟,分析不同的突变蛋白的Rg值变化,得到最优的突变蛋白。（3）验证突变对IN蛋白稳定性和识别连接能力的影响。根据分子模拟结果使用PCR技术对IN蛋白进行改造,得到的最优的IN蛋白,进其进行断裂反应,分析突变对IN蛋白稳定性和识别连接能力的影响。（4）研究Cfa Dna E内含肽IN、IC之间的相互作用。本研究首先根据IN、IC片段的氨基酸序列构建了IN、IC蛋白的三维模型,在模型的基础上进行IN、IC的分子对接,结合已有的Npu Dna E、Ssp Dna E等内含肽的三维模型和对接模型评分,选出最优的蛋白复合物模型。以该模型为研究对象,分析相互作用力大小及作用区域,结果显示在IC的第12、14、15位氨基酸位点都具有2个氢键,因此,认为12到15位氨基酸之间为相互作用关键区域。（5）构建IC突变蛋白。为了进一步优化亲和层析系统的再生条件,本实验的主要研究手段是结合蛋白质工程,计划在IC中插入甘氨酸以降低稳定性。为了研究甘氨酸插入数量对IC稳定性的影响,在IC蛋白的第12、15号位之间插入3、6、12、18个甘氨酸。（6）研究突变对IC蛋白的影响。在上柱洗脱实验插入3、6个甘氨酸后IC-GFP-D蛋白在0.1 M的Na OH洗脱条件下洗脱效果明显。通过断裂反应分析突变对识别连接的影响,发现插入甘氨酸会导致断裂速率略微下降,但断裂率并没有明显的影响。同时,静态吸附实验中,插入甘氨酸会使载量下降,但仍在可接受的范围内。将突变蛋白应用于蛋白纯化,发现未对纯化效果产生明显影响。在重复上样实验中IC-6G能保持约95%的再生率,较IC有明显提升。综上,插入六个甘氨酸的IC为最优的突变蛋白。