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由变应原引起的变态反应性疾病(如哮喘、变应性鼻炎等)是当前世界性的重大卫生学问题,总发病率高达10~30%,并有逐年增多的趋势。粉尘螨是最主要的吸入性变应原之一。
本研究围绕粉尘螨变应原的基础研究,从以下三个方面进行了实验研究并取得了相应的结果:
(1)进行变应原主要成份。Der f 2定位的研究:制作粉尘螨石蜡切片,先用抗重组Der f2单克隆抗体作为一抗孵育,再选用荧光素:FITC标记的抗鼠:IgG抗体作为二抗,荧光染色后在荧光显微镜下观察Der f2蛋白在螨体内的位置;研究发现Der f2定位于粉尘螨的中肠组织及其肠内容物中。与国外采用冰冻切片的技术相比,本研究采用的石蜡切片技术进行粉尘螨Der f2变应原荧光定位获得的图象更加清晰,结构更加完整。
(2)粉尘螨3类变应原基因工程的研究:取经实验室培养的纯粉尘螨(约500只)提取总RNA,经逆转录RT-PCR扩增Der f 3基因后测序;将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。转化进E.Coli BL2l(DE3)后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,蛋白质印迹(Western blotting)分析该纯化Der f3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE的反应性,以鉴定重组rDer f3的变应原性。结果表明,本研究从华南地区克隆了一株Der f3 基因,该基因与GenBank(D63858)公布的Der f3 比较有3个核苷酸差别,二者同源性为99.6%。工程菌经IPTG诱导后高效表达Der f3重组蛋白(表达量达30%),主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该纯化的重组蛋白具有变应原性。本文首次从华南地区克隆了一株新的粉尘螨3类变应原的基因序列并且完成了基因工程制备。
(3)进行粉尘螨变应原疫苗生物活性的测定方法的改进研究:粉尘螨变应原生物学活性的测定是变应原疫苗标准化的关键技术之一。美国食品药物管理局(FDA)推荐体外竞争ELISA法测定粉尘螨变应原生物学活性的方法,实验表明该方法检测灵敏度不够。经分析可能是由于血清中的大量IgG与极少量的特异性IgE竞争有限的包被抗原所造成的干扰引起的,为此,我们对这一方法进行了改进。通过重组蛋白A琼脂糖凝胶预吸附血清中的IgG,以FDA批准的粉尘螨变应原提取物(疫苗)Df作为包被抗原,同样的以FDA批准的粉尘螨变应原提取物(疫苗)作为竞争抗原,一抗用处理的血清,对照为未处理的血清和正常人血清,二抗用生物素标记的抗人IgE,建立竞争性ELISA实验方法;同时,用间接法检测血清中特异性IgG和特异性IgE的含量观察吸附效果。用这一改进的方法检测本研究室连续三批生产的粉尘螨变应原疫苗的生物学活性。结果表明,重组蛋白A琼脂糖凝胶预吸附血清中的IgG后用于测定粉尘螨变应原疫苗生物活性,显著提高了测定的灵敏度和准确性,测得的连续三批粉尘螨变应原疫苗比活性分别为:29.36AU/ug、32.67AU/ug和38.23AU/ug,平均为:33.42AU/ug,与平均比活性的差异在-12.15%-+14.39%之间,符合SFDA的标准即要求所测得的抗原效价应在标示效价的50%-200%之间的要求。本文在国内外首次报道了采用消除IgG干扰的方法进行粉尘螨变应原疫苗生物活性的测定方法的改进。
上述三项有关粉尘螨变应原的基础研究为今后粉尘螨过敏性疾病的特异性诊断、治疗和预防奠定工作基础。