第一部分pbroad-nestin转基因小鼠的制作背景Nestin是第六类中间丝蛋白,通常表达于发育中的神经干/祖细胞。在胚胎发育过程中,逐渐被其它的组织特异性中间丝所取代。但nestin体内的确切功能并没有明确。Nestin勺基因敲除小鼠表明：nestin+/-基因型的杂合子小鼠中,虽然nestin勺表达量大幅减少,但并不引起可见的表型。说明nestin的表达量可能并不影响小鼠的发育和生存。但纯合子小鼠,(?)nestin-/-基因型的小鼠在胚胎发育过程中神经管发育缺陷并致死。Nestin缺失可引起神经管细胞大量凋亡,且导致凋亡的作用和nestin的细胞骨架功能无关。Nestin也表达在神经系统之外的其它地方,但nestin的基因敲除小鼠在其它含有nestin阳性细胞的部位并未发现明显异常。可见nestin的体内功能复杂。而nestin过表达的转基因小鼠将有助于阐明nestin的体内功能。Nestin表达模式特别。其一般表达于分化未成熟的细胞,细胞分化成熟后其表达下降直至不表达。Nestin过表达能否维持细胞的增殖状态?发育过程中过表达能否影响细胞的正常凋亡过程?Nestin表达部位也特别。一般情况下,nestin表达于细胞质内,但有些细胞又表达于核上。说明nestin可能与DNA或者核蛋白有相互作用,通过影响染色体的形态或者结构来影响其它基因的表达。Nestin过表达能否通过这个作用影响损伤修复?为此,我们用显微注射的方法来制作nestin过表达的转基因动物模型,以此来探讨nestin的体内功能。方法：以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分3段扩增出nestin的全长DNA,并将其克隆入含有强启动子rosa26的载体中,以期获得较好的过表达。构建好的载体酶切鉴定,测序,去除原核序列,纯化；显微注射前还要准备好几种小鼠,包括供卵鼠,种雄,假孕母鼠,结扎公鼠等,然后将构建好的载体用原核注射的方法注入受精卵内。将受精卵植入假孕母鼠体内。有些卵会发育成熟并出生。结果：构建的载体酶切结果正确。测序结果与Pubmed上公布的序列相符。共成功注射(注射后存活)273枚受精卵,回种入11只假孕母鼠体内,出生小鼠34只。结论：成功构建了表达载体pBroad3-nestin并将其导入到受精卵中。第二部分转基因动物的检测背景大多数外源基因在导入宿主动物基因组后,都能较“真实”的表达并使宿主动物产生特定的表型特征。然而,外源基因在转基因动物及其子代中也有时发生拷贝数丢失和表达沉默的现象。究其原因,主要与位置效应、外源基因的表观遗传学修饰和遗传效率相关。其中,表观遗传学修饰是指DNA序列变化以外的可遗传的基因表达改变,这种影响基因转录活性而不涉及DNA序列改变的基因表达调控方式称为表观转录调控。目前研究比较透彻的表观遗传学修饰作用机制包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化。不仅在不同组织中,即使是同一组织的不同细胞中,外源基因的表达也有可能不同,这主要是由于不同细胞中外源基因甲基化水平不同导致的。另外,外源基因拷贝数在各组织器官中存在显著差异,这可能与外源基因在不同组织器官中遗传效率不同有关。由此可见,转基因动物不同器官中外源基因的表达情况是有可能不同的。为了检测转入的nestin的表达情况,我们对主要器官进行了检测。方法：先用PCR的方法筛选基因组中有外源基因(nestin)整合的小鼠。将有外源nestin整合的小鼠传代扩种。携有外源基因的小鼠将外源基因稳定传至第3代之后用作实验用鼠。小鼠分2组,每组3只,5-8周大小,雄性。麻醉后取材主要器官：心、肺、脑、肾等。用Western Blot的方法检测nestin的表达量。比较转基因鼠和野生鼠nestin表达量(灰度值)之间的差别是否具有统计学意义。结果：PCR筛选出2个有外源基因整合的小鼠品系。(后面的检测只选取了1个品系)。有外源基因整合的小鼠的脑、肺中nestin表达量较野生鼠为高,差别具有统计学意义(肺：F=10.539,P=0.048；脑：F=923.313,P<0.001),而心和肾中nestin表达量与野生鼠差别无统计学意义(肾：F=0.571,P=0.505；心：F=7.219,P=0.075)。结论：nestin过表达的转基因鼠构建成功,其心和肾中有nestin过表达。第三部分Nestin在过表达转基因小鼠肝脏中的表达及其对肝脏增殖的影响背景无论在正常组织还是异常组织中,nestin的表达常提示未分化状态或者增殖潜力的增加。特别是增强神经祖细胞的增殖。nestin日性细胞参与多种组织的损伤修复。参与修复的过程中常增强细胞的增殖能力。但也有体外的实验中,nestin与增殖无直接相关。在nestin被siRNA敲减之后,培养的星形细胞瘤细胞生长减弱,但ki67的表达并不减少。体内研究显示：nestin基因敲除的小鼠中,nestin高表达的中枢神经细胞的凋亡增加,增殖并未受到影响。上述的研究结果表明,nestin与增殖的关系并未得到阐明。为了明确nestin与增殖的关系,我们研究过表达转基因小鼠的肝脏中,nestin与增殖的关系。肝脏在细胞增殖方面是属静止器官,通常仅0.0012%-0.01%肝细胞在进行分裂,但在重大创伤或中毒情况下肝脏表现出强大的再生能力。动物实验结果结果显示肝部分切除(PHx)后30min内便有早期反应基因的诱导表达,细胞DNA的合成增加,但要数天后才会达到峰值。也就是说,肝脏容易形成2种“极端”的细胞增殖情况：极少增殖和活跃增殖。在肝脏有nestin过表达的前提下,nestin过表达如果对增殖有影响,都可表现出来。方法：先用荧光定量PCR、免疫组化和Western blot的方法检测肝脏中nestin的表达,以证实肝脏中nestin的过表达状态。然后将小鼠分成4组：腹腔注射BrdU(按120mg/kg),第一、二组2小时后麻醉,灌注取材；第三、四组分别于切除术后24小时(4只小鼠),72小时(4只小鼠)腹腔注射BrdU(按120mg/kg),注射后2小时灌注取材。常规石蜡切片,每个标本做5张切片,选取5个高倍视野计数BrdU阳性细胞占细胞总数的百分比(标记率L)。结果：荧光定量PCR, western blot,和免疫组化都证实肝脏中nestin的高表达,且在肝脏中,nestin表达于整个细胞。在静息状态下,野生鼠和nestin过表达的转基因鼠肝脏BrdU标记率几乎为零；但在肝大部切除的情况下,nestin过表达的转基因鼠有更多的细胞进入增殖状态,表明增殖能力增强,差别具有统计学意义(24小时：t=2.996,P=0.024；72小时：t=2.915,P=0.027)结论：Nestin过表达对静息状态下的肝脏增殖无影响,但可增加损伤修复情况下脏脏的增殖状态,其差别具有统计学意义(24小时:t=2.996,P=0.024；72小时：t=2.915,P=0.027)。