L-叔亮氨酸(L-tert-Leucine)是一种非蛋白原的手性氨基酸,可用于不对称化合物的合成以及合成多中活性药物。目前L-叔亮氨酸的合成主要有化学法和生物法的两种合成方法。使用生物法进行合成,L-叔亮氨酸可以以三甲基丙酮酸为底物通过亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase,LeuDH)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)催化生成。本文就L-叔亮氨酸的合成进行了探索,研究了生物法合成L-叔亮氨酸的反应条件。首先扩增得到来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶基因和来自博伊丁假丝酵母(Candida bioidnii)甲酸脱氢酶基因,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达。构建得到重组菌株pET-28a-LeuDH和pET-28a-FDH。以三甲基丙酮酸为底物,使用重组菌株混合全细胞和菌体破碎液分别催化合成L-叔亮氨酸。经反应条件优化,1 mL重组菌全细胞转化最高生成产物1.05 mg,而超声破碎后最高转化生成4.5 mg产物。此外,将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行串联表达,得到重组菌株pET-28a-LeuDH-FDH和pET-28a-FDH-LeuDH,并成功转化生成L-叔亮氨酸。经反应条件优化,1 mL串联表达重组菌株pET-28a-LeuDH-FDH超声破碎后,最高转化出3.375 mg L-tert-Leucine,而使用全细胞则最高转化出1.635 mg。上述结果同时表明,底物和辅因子的穿膜是反应的重要限速环节,因此破碎液催化效果好于全细胞催化,而使用全细胞催化时,串联表达重组菌株催化效果优于分别表达两种酶的重组菌株混合催化效果。为了获得高的转化效率,同时避免菌体破碎过程,本文还尝试将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶构建到毕赤酵母中进行分泌表达。构建表达载体pPIC9K-LeuDH和pPIC9K-FDH并导入毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,获得重组菌株GS115/pPIC9K-LeuDH和GS115/pPIC9K-FDH。蛋白电泳显示两种酶均成功表达出可溶性蛋白,但发酵上清及浓缩液活性低,无法成功转化生成叔亮氨酸。综上所述,本课题成功使用微生物转化法合成叔亮氨酸,产量最高达到4.5 mg/mL。构建了LeuDH和FDH的大肠杆菌表体系和毕赤酵母表达体系。使用大肠杆菌表达体系将两种酶基因进行了串联表达并用全细胞合成L-叔亮氨酸。这些研究为L-叔亮氨酸的生物合成提供了理论依据并具备一定的实用价值。