研究背景:慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是造血干细胞发生恶性克隆产生的一种疾病,按临床病程可分为慢性期(Chronic Phase,CP)、加速期(Accelerated Phase,AP)和急变期(Blast Crisis,BC)。一旦进入急变期,预后极差。费城染色体(Ph)和BCR-ABL基因融合是CML的标志性改变。抑制酪氨酸激酶活性的抑制剂伊马替尼(Imatinib,IM)能够靶向BCR-ABL融合蛋白,成为目前CML治疗的一线药物。然而,随着时间的推移,越来越多的CML患者出现IM耐药,这严重制约了 CML疗效的提高,目前已成为CML靶向治疗面临的主要挑战。研究发现,CML患者IM耐药的主要原因之一是BCR-ABL基因点突变或扩增导致的酪氨酸激酶活性持续增高。因此,探索BCR-ABL依赖IM耐药的机制及其逆转对策是当前临床上CML治疗关注的焦点。越来越多的证据显示,DNA损伤修复对基因组维持完整性和稳定性至关重要,其功能异常导致的基因组不稳定与CML疾病进展及耐药性的产生关系密切。研究显示,阻断DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)的修复能使CML细胞Mo7e-P210 IMR和Baf3-P210 IMR对IM敏感性增强。另有研究报道,应用小分子抑制剂IBR2下调DNA损伤修复相关基因RAD51的表达,可引起IM耐药细胞T315I-Ba/F3增殖受抑、凋亡增加,并明显增强耐药细胞对IM的敏感性。由此可见,DNA损伤修复在CML细胞IM耐药中发挥着重要作用,可能是一种新的IM耐药机制,阐明其作用机理对克服IM耐药具有重要意义。近来研究显示,增殖特异性癌基因FoxM1(Forkhead box protein M1)能够靶向BRIP1、RAD51、BRCA2等多种DNA损伤修复蛋白,调控DNA损伤修复,在胶质母细胞瘤、乳腺癌等多种肿瘤的化疗药物抵抗中发挥重要作用。FoxM1可调节细胞周期相关特异性基因的转录,与细胞增殖、组织再生、胚胎发育、DNA损伤修复和肿瘤形成密切相关。新近研究证明,FoxM1在乳腺癌等多种肿瘤中过表达,其高表达的肿瘤具有低分化、恶性程度高、易远处转移的特点,临床预后不佳。FoxM1通过调控其下游肿瘤相关基因的表达,影响基因组的稳定性及有丝分裂的进程,从而促进肿瘤增长、侵袭和转移,在肿瘤的发生、发展中起关键作用。综上,FoxM1是肿瘤增殖所必需的转录因子,探讨其在CMLIM耐药中的作用及机制,可为逆转IM耐药带来全新的治疗思路和方案,提供临床治疗的新靶点。研究目的:研究FoxM1在不同临床分期的CML患者中表达水平,分析FoxM1表达与疾病进展及IM耐药的关系,探讨FoxM1对CML预后的临床意义;研究干预FoxM1表达对CML细胞生物学行为的影响;阐明FoxM1对DNA损伤修复的调控作用,进一步揭示FoxM1参与IM耐药的作用机制。研究方法:1.检测CML患者FoxM1表达,分析其与CML疾病分期和IM耐药的关系,评价FoxM1分子对CML发病及预后的临床意义。1.1标本收集:收集50例CML患者及12例正常对照者骨髓的标本,CML患者分为慢性期(CP)组38例,加速/急变期(AP/BP)组12例,其中初诊组19例。使用淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法来分离单个核细胞,-80℃冻存。1.2免疫磁珠分选骨髓CD34+及CD34-单个核细胞:骨髓单个核细胞总数>1× 108的CML患者标本13例及脐带血标本6例,使用淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法来分离出单个核细胞后,留取1× 106个细胞,-80℃保存备用;剩余细胞使用CD34+磁珠分选法获得CD34+及CD34-细胞,-80℃保存备用。1.3实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应法(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测 Fox M1 的表达水平:采用 TRIzol法提取细胞总RNA,应用PrimeScript RT reagent试剂盒将RNA逆转录为cDNA,SYBR Green法检测CML患者及正常对照者的单个核细胞、CD34+及CD34-单个核细胞中Fox M1表达情况。2.研究IM耐药CML细胞株K562/G01及其IM敏感株K562对IM的药物敏感性、FoxM1表达及DNA损伤修复情况。2.1 CCK8法检测CML细胞对IM敏感性:配制不同浓度梯度的IM溶液,分别处理IM敏感株K562细胞和IM耐药株(BCR-ABL过度扩增)K562/G01细胞48小时,CCK8法检测并计算细胞存活率及IC50值。2.2AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术(FACS)检测细胞凋亡率:IM分别处理K562细胞和K562/G01细胞48h,Annexin V-FITC和PI进行双染细胞,应用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。2.3 Westem-blot 法检测 K562 细胞及 K562/G01 细胞的 FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白及DNA损伤标志物的表达:细胞总蛋白提取液分别提取K562细胞和K562/G01细胞的总蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl及DNA损伤标志物Y-H2AX的表达。2.4免疫荧光法检测细胞DNA损伤修复情况:同样浓度的IM处理K562细胞和K562/G01细胞6小时,利用免疫荧光法检测细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达。3.研究干预FoxM1表达对CML细胞生物学行为的影响。3.1上、下调CML细胞中FoxM1的表达:(1)慢病毒感染细胞:分别应用FoxM1携带过表达载体的慢病毒及其过表达对照病毒感染IM敏感细胞株K562;应用携带FoxM1干扰片段shRNA的慢病毒及其干扰对照病毒感染IM耐药细胞株K562/G01。使用嘌呤霉素(puromycin)筛选2周,获得稳定过表达或低表达FoxM1的CML细胞株。(2)利用FoxM1的小分子抑制剂下调CML患者CD34+细胞中FoxM1表达:硫链丝菌素(Thiostrepton,TST)、硼替佐米(Bortezomib,BTZ)处理K562/G01细胞及CD34+细胞48小时。3.2 Real-time RT-PCR法检测干预FoxM1表达后CML细胞的FoxM1及其下游分子的mRNA表达水平。3.3 Western-blot法检测干预FoxM1表达后CML细胞的FoxM1分子、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr、P-Crkl的表达。3.4 CCK8法研究干预FoxM1表达后CML细胞IM敏感性的改变:配制不同浓度梯度的IM溶液处理各组细胞,48小时后检测并计算细胞存活率及IC50值。3.5流式细胞术检测干预FoxM1表达后CML细胞株和原代CD34+细胞的凋亡情况:IM处理各组细胞,48小时后收集细胞,AnnexinV-FITC/PI进行双染后,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。3.6 Western-blot检测干预FoxM1表达后CML细胞DNA损伤标志物γ-H2AX的蛋白表达水平;免疫荧光法检测干预FoxM1表达后CML细胞的DNA损伤修复情况:IM处理各组细胞,利用免疫荧光法检测细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX的表达。4.筛选并鉴定参与CML细胞IM耐药的FoxM1关键下游DNA损伤修复基因。4.1全基因表达谱芯片法:分别收集FoxM1过表达及FoxM1 shRNA慢病毒处理前后的CML细胞,利用基因芯片检测各组间差异表达的基因,作为FoxM1调控的参与IM耐药的候选下游DNA损伤修复基因。4.2 Real-time RT-PCR法验证各候选下游DNA损伤修复基因表达:在FoxM1过表达慢病毒感染前后CML细胞中检测各候选DNA损伤修复基因的mRNA表达水平。选择一个表达差异显著的候选下游基因作为目标下游DNA损伤修复基因。4.3 Western-blot法验证目标FoxM1目标下游DNA损伤修复基因的表达:细胞总蛋白提取液提取干预FoxM1表达的CML细胞的总蛋白,进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测目标下游DNA损伤修复基因蛋白水平的表达。5.研究FoxM通过调控目标下游DNA损伤修复基因,对CML细胞生物学行为产生的影响。5.1质粒及病毒转染:应用携带目标下游DNA损伤修复基因干扰片段shRNA的慢病毒及其干扰对照病毒感染K562/G01细胞;应用LipofectamineTM2000将携带目标下游DNA损伤修复基因过表达载体的质粒及其过表达对照质粒转染FoxM1低表达的K562/G01细胞(感染携带FoxM1干扰片段shRNA慢病毒并稳定表达的K562/G01细胞)。嘌呤霉素筛选2周后获得稳定过表达或低表达目标下游DNA损伤修复基因的细胞株及其对照细胞株。5.2 Real-time RT-PCR检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞中其mRNA表达水平;Western-Blot检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞中其蛋白表达水平、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr。5.3 CCK8法检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞对IM的敏感性:IM处理各组细胞48小时后,CCK8法检测并计算细胞的存活率及IC50值。5.4流式细胞术检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞的凋亡情况:IM处理各组细胞,48小时后收集细胞,AnnexinV-FITC/PI进行双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率。.5.5 Western-Blot检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX的蛋白表达水平;免疫荧光法检测干预目标下游DNA损伤修复基因后CML细胞的DNA损伤修复情况:IM处理各组细胞,6小时后应用免疫荧光法检测各组细胞DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白水平的表达。实验结果1.FoxM1在CML患者及正常对照中的表达。1.1 FoxM1在CML患者与正常对照中的表达:Real-time RT-PCR结果显示在初诊CML患者中FoxM1 mRNA的表达水平显著高于正常对照组;FoxM1表达与CML患者疾病分期有关,AP/BP组患者的FoxM1表达水平明显高于CP组患者;FoxM1表达与IM敏感性有关,初诊CP患者经IM治疗无效后如进展为AP/BC,其FoxM1表达水平呈上升趋势;初诊CP患者经IM治疗后若稳定于完全缓解阶段,其FoxM1表达水平呈下降趋势。1.2 FoxM1在CML干细胞中的表达:FoxM1 mRNA在CML患者CD34+细胞中的表达水平明显高于CD34-细胞和正常对照组CD34+细胞;在正常对照组CD34+及CD34-细胞的FoxM1 mRNA表达水平差异无统计学意义。2.所选IM耐药CML细胞株K562/G01及其敏感株K562对IM的药物敏感性。2.1 CCK8法显示IM耐药株K562/G01细胞对IM的IC50为IM敏感株K562的约40倍。2.2流式细胞术显示IM处理细胞48h后,K562/G01细胞的凋亡率明显低于K562细胞。2.3 Western-blot 显示 K562/G01 细胞中 FoxM1、BCR-ABL 激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl的表达明显高于K562细胞,DNA损伤标志物γ-H2AX表达明显低于K562细胞。2.4免疫荧光法显示K562/G01细胞中DNA损伤标志物γ-H2AX表达明显低于K562细胞。3.FoxM1调控CML细胞BCR-ABL激酶活性及IM敏感性检测。3.1上调IM敏感细胞株K562中FoxM1表达对细胞IM敏感性的影响:Real-time RT-PCR、Western-blot 验证 FoxM1 mRNA 及蛋白水平上调后,CCK8法显示细胞存活率升高,IC50值增大;流式细胞术检测细胞凋亡明显减少;Western-blot显示BCR-ABL激酶活性标志P-Tyr、P-Crkl蛋白表达水平升高;Western-blot及免疫荧光显示DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平降低。3.2下调IM耐药细胞株K562/G01中FoxM1表达对细胞IM敏感性的影响:Real-timeRT-PCR、Western-blot 验证 FoxM1 的 mRNA 及蛋白水平下调后,CCK8法显示细胞存活率降低,IC50值减小;流式细胞术显示细胞凋亡显著增加;Western-blot检测BCR-ABL激酶活性标志P-Tyr、P-Crkl蛋白表达水平降低;Western-blot及免疫荧光显示DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平升高。3.3应用FoxM1的小分子抑制剂下调CML患者骨髓CD34+细胞的FoxM1表达对细胞IM敏感性的影响:Annexin-VFITC/PI进行双染,流式细胞术显示细胞凋亡明显增加。4.鉴定并选择参与IM耐药的FoxM1下游关键的DNA损伤修复基因。4.1根据芯片结果及比较干预FoxM1前后CML细胞中各候选基因mRNA表达水平结果,初步选择PARP作为FoxM1调控参与IM耐药的目标下游DNA损伤修复基因。4.2 IM 耐药细胞株 K562/G01 中下调 PARP 的表达:Real-time RT-PCR、Western-Blot验证PARP的mRNA及蛋白表达水平降低;CCK8法显示细胞存活率降低,IC50值减小;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示细胞凋亡增加;Western-blot、免疫荧光显示DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平升高。4.3 FoxM1 低表达的 K562/G01 细胞中上调 PARP 的表达:Real-time RT-PCR、Western-Blot验证PARP的mRNA及蛋白表达水平升高;CCK8法显示细胞存活率升高,IC50值增大;AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术显示细胞凋亡减少;Western-blot、免疫荧光显示DNA损伤标志物γ-H2AX表达水平降低。实验结论1.FoxM1在初诊CML患者中明显高表达,在不同疾病分期及不同IM疗效的CML患者中存在明显差异表达,提示了 FoxM1可能参与CML疾病发生发展过程,且可能与CMLIM耐药关系密切。2.FoxM1在CML患者CD34+细胞中表达量明显高于其CD34-细胞和正常对照组CD34+细胞,提示FoxM1在维持CML干细胞的存活和自我更新中起一定的作用。3.FoxM1信号通路可通过促进DNA损伤修复,抑制CML细胞凋亡并增强BCR-ABL激酶活性,从而促进IM耐药。4.鉴定出PARP是FoxM1调控参与IM耐药的下游关键DNA损伤修复基因。阐明FoxM1通过调控DNA损伤修复相关基因PARP的表达介导IM耐药。