研究背景恶性肿瘤的发病率逐年上升,严重威胁人类的健康和生活。乳腺癌现在是女性最常见的恶性肿瘤之一,发病率正逐年上升。在欧美国家,乳腺癌的比例达到女性恶性肿瘤的25%～30%。20世纪末,统计资料表明全世界大约有130万人诊断为乳腺癌,而且有40万人死于该病。肿瘤治疗的方法包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗、生物治疗以及各种微创治疗手段等。微创治疗包括光动力治疗、冷冻、射频、介入治疗、微波等等。随着社会的发展,人们不仅会关注疾病本身,而且也会更加关心外观、功能和心理状态。光动力治疗作为一种有着巨大潜能的治疗手段,以其安全、有效、副作用小、可重复性好、保护容貌和器官功能、相对成本低和可协同性等优点在肿瘤的治疗中的作用脱颖而出。对于癌前病变和早期肿瘤,光动力治疗可以达到治愈效果。而对于晚期肿瘤,光动力治疗也可以作为一种姑息治疗的手段减轻患者的症状,提高其生活质量。光动力治疗不但可以应用于皮肤浅表部位的肿瘤,也可以用于呼吸道、胃肠道、膀胱等部位的肿瘤,同时,也可以在一些非肿瘤的疾病中发挥重要作用,如年龄相关性黄斑变性、尖锐湿疣、抗细菌和病毒等等。光动力治疗的最大优势是保护容貌和重要器官功能。血卟啉衍生物是第一代光敏剂,经过多年的实验和临床研究证明是有效的,现已广泛用于临床。光动力治疗利用光敏剂在一定的时间后选择性积聚在肿瘤组织中的特性,可以选择性地杀伤肿瘤细胞。应用特定波长的激光照射局部肿瘤组织,可以激活光敏剂,使光敏剂与肿瘤细胞内的氧分子发生光化学作用,产生一系列化学性质活泼的单态氧(1O2)和其他一些活性氧物质(Radical oxygen species, ROS),它们可以氧化损伤细胞内的蛋白质、核酸等大分子物质,发生以下反应：1.直接杀伤细胞；2.破坏肿瘤组织中的微血管,造成局部缺血缺氧环境,导致肿瘤细胞的死亡；3.局部氧化应激反应可以激活补体系统,能促使多种炎症及免疫因子产生及释放,诱导各种炎症细胞、免疫细胞快速浸润至肿瘤局部组织,最后形成全身性的抗肿瘤反应。光动力治疗三要素：1.光敏剂-系统或局部应用；2.激光-与光敏剂最大吸收波长相适应的近红外激光；3.氧-能够在激发后变成单态氧(’O2)的分子氧。光动力治疗虽然有很多优点,但是也有其本身的不足,导致其应用受限。例如,现有光动力技术的透射深度有限,肿瘤消退后复发率较高,对远处转移病灶治疗效果有限等。其作用受限的其中一个原因就是光敏剂在肿瘤细胞内的聚集有限,导致产生的活性氧物质不足以杀灭肿瘤细胞。肿瘤在进行光动力治疗后容易复发,患者的生命健康再次受到威胁。有研究表明骨化三醇可以通过提高粪卟啉原合成酶的表达,从而增加ALA在胶质瘤细胞内卟啉原的含量,从而增强光动力治疗肿瘤的疗效。为了研究骨化三醇对乳腺癌细胞是否有类似的作用,我们设计了此课题来研究增强光动力治疗乳腺癌疗效的方法。研究目的1.探讨骨化三醇体外对人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231生长的影响,以确定骨化三醇对乳腺癌细胞的合适的无毒浓度。并选择合适的血卟啉注射液浓度作为光动力治疗的终浓度。2.应用激光光照细胞,处理后检测各组细胞的吸光度(OD)值,计算各组细胞的抑制率,确定何种处理方法对细胞的杀伤作用最强。3.检测各组细胞处理后的凋亡率,ROS产生的量,确定何种处理方法对细胞的凋亡及活性氧的产生影响最大。4.检测各组细胞的荧光强弱,推测细胞内卟啉原含量的高低。应用RT-PCR检测细胞内卟啉原合成酶的表达,证实癌细胞内卟啉原含量增加与卟啉原合成酶的表达升高有关。研究方法和内容1.通过MTT法检测各组细胞活性,利用多功能酶标仪检测细胞OD值,研究不同浓度的骨化三醇对MCF7和MDA-MB-231细胞的影响,确定并选择合适的对细胞生长无影响的骨化三醇浓度。2.将细胞分为五组,分别为实验组(PDT+骨化三醇)、光敏剂组(PDT)、骨化三醇组(光照+骨化三醇)、光照组(仅光照)和空白对照组,分别予以不同的处理。处理结束后24h显微镜下观察细胞,用MTT法测各组细胞的OD值,计算细胞活性。实验重复三次。3.细胞处理如上,处理结束后8h应用FITC/PI双染法流式细胞术检测各组细胞的凋亡率,统计早期凋亡率和晚期凋亡率之和。细胞处理结束后,加入活性氧物质(ROS)检测试剂,30分钟后检测各组细胞活性氧物质强度值,并在荧光显微镜下观察各组细胞荧光。4.细胞接种完成后,分别加入骨化三醇和(或)血卟啉注射液,24h后去除培养液,用PBS液清洗3遍,再加入PBS液,利用多功能酶标仪检测各组细胞光敏剂产生的荧光。5.将乳腺癌细胞分别分为两组,分别为实验组(骨化三醇预处理)和对照组(不处理)。经骨化三醇处理后48小时,收集各组细胞的RNA,经逆转录后进行RT-PCR实验,检测卟啉原合成酶系中是否有表达增加的酶。卟啉合成酶系：(PBGD(卟啉原脱氨酶),UROS(尿卟啉原合成酶),CPOX(粪卟啉原氧化酶)和FECH(铁螯合酶),各个酶类的mRNA基因序列如下表。研究结果1.选择骨化三醇对乳腺癌细胞的无毒浓度根据骨化三醇说明书及相关文献报道,设置浓度梯度。骨化三醇浓度为10-8M、10-10M时,对MCF7细胞的抑制率分别为23.53%±4.96%、9.77±1.78%,差异有统计学意义(P<0.01),浓度为10-12M、10-14M、10-16M时,抑制率分别为0.70%±0.17%、0.67%±0.07%、0.35%±0.16%,差异无统计学意义(P>0.05)。骨化三醇浓度为10-8M、10-10M时,对MDA-MB-231细胞的抑制率分别为24.33%±5.13%、14.80%±5.24%,差异有统计学意义(P<0.01),浓度为10-12M、10-14M、10-16M时,抑制率分别为1.36%±0.34%、1.52%±0.35%、1.10%±0.14%,差异无统计学意义(P>0.05)。由实验结果可以看出,当骨化三醇浓度低于或等于10-12M时,其对细胞生长和活性无影响。为了排除骨化三醇本身对实验的影响,所以选取10-12M作为本研究中细胞的实验浓度。2.光动力治疗后各组细胞的抑制率比较经过光照后,MCF7乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组,空白光照组抑制率分别为89.03%±0.79%、77.76%±2.27%、20.54%±2.32%、18.06%±3.60%,实验组抑制率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231乳腺癌细胞光照后实验组、光敏剂组、骨化三醇组,空白光照组抑制率分别为75.82%±1.43%、46.38%±0.64%、16.98%±0.28%、13.49%±2.04%。实验组抑制率最高,差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞光照后检测ROS值细胞经过照光后30min开始收集细胞检测ROS。MCF7乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组ROS检测值量化后分别为3.903±0.098、2.713±0.218、2.239±0.945、1.835±0.127、0.561±0.004。实验组ROS检测值最高,差异有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组量化后分别为3.628±0.045、2.269±0.175、1.649±0.296、1.472±0.098、0.573±0.096。实验组ROS检测值最高,差异有统计学意义(P<0.01)。4.细胞光照后细胞凋亡率检测细胞光照后8h收集细胞进行凋亡检测。统计早期凋亡和晚期凋亡比例之和。MCF7乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组凋亡率分别为0.4407±0.01255、0.19±0.0094、0.1023±0.0023、0.0680±0.02703、0.0047±0.0009。实验组凋亡率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组分别为0.3110±0.0087、0.1980±0.0040、0.0903±0.0030、0.0623±0.02630、0.0073±0.0009。实验组凋亡率最高,差异有统计学意义(P<0.01)。5.细胞荧光强度检测MCF7乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组荧光强度检测值分别为386.056±13.540、285.871±13.292、2.702±0.199、2.750±0.239、2.904±0.142。实验组荧光强度检测值最高,差异有统计学意义(P<0.01)。MDA-MB-231乳腺癌细胞实验组、光敏剂组、骨化三醇组、空白光照组、空白组荧光强度检测值分别为313.254±6.084、250.048±3.156、2.798±0.181、2.683±1.400。实验组荧光强度检测值最高,差异有统计学意义(P<0.01)。6. RT-PCR实验RT-PCR实验表明,两株乳腺癌细胞的卟啉生物合成酶系PBGD(卟啉原脱氨酶),UROS(尿卟啉原合成酶),CPOX(粪卟啉原氧化酶)和FECH(铁螯合酶)中,只有CPOX表达增加(P<0.05)。研究结论1.经过骨化三醇预处理的乳腺癌细胞,当浓度≥10-10M时,处理组细胞的抑制率高于空白对照组(P>0.05)。而骨化三醇浓度≤10-12M时,处理组细胞抑制率与空白对照组无差异(P>0.05)。为了排除骨化三醇本身对乳腺癌细胞生长的影响,选择骨化三醇浓度为：10-12M。2.各组乳腺癌细胞经光动力治疗后,实验组抑制率最高。骨化三醇组与空白光照组经过处理后,对乳腺癌细胞的抑制率无差异(P>0.05)。说明合适浓度的骨化三醇本身在没有光敏剂的作用下,对光照作用的强弱无影响。3.各组乳腺癌细胞经光动力治疗后,实验组ROS检测值最高。骨化三醇组与空白光照组经过处理后,ROS检测值无差异(P>0.05)。说明合适浓度的骨化三醇预处理后对乳腺癌细胞光照后活性氧的产生无影响。4.各组乳腺癌细胞经光动力治疗后,实验组凋亡率最高。骨化三醇组与空白光照组经过处理后,两组细胞的凋亡率无差异(P>0.05)。5.各组乳腺癌细胞荧光检测值实验组最高。乳腺癌细胞经过骨化三醇预处理后,细胞内光敏剂含量增加。此实验检测的荧光由光敏剂发出,骨化三醇组与光照组无光敏剂处理,两组荧光强度值对比无差异。6. RT-PCR实验表明,CPOX(粪卟啉原氧化酶)表达增加。CPOX(粪卟啉原氧化酶)为卟啉原合成酶系的酶类,说明乳腺癌细胞内光敏剂含量增加与细胞本身CPOX(粪卟啉原氧化酶)表达增加有关。总之,骨化三醇可以增强HpD-PDT治疗乳腺癌的效果。在光照后,实验组的ROS产生更多,细胞凋亡率更高。骨化三醇在没有光敏剂存在的情况下,本身并不能增加光动力治疗的效果。机制研究表明,实验组经过骨化三醇和光敏剂预处理后荧光强度更高,细胞内原卟啉含量更高。经过骨化三醇处理的细胞CPOX表达增加,CPOX为原卟啉合成的关键酶,说明细胞内原卟啉含量增加与细胞CPOX表达增加有关。