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目的:颞叶癫痫是一种难治性癫痫,是神经科常见的临床综合征,其发病机制尚未完全阐明。目前Akt在神经系统疾病中的作用是神经病学研究的热点之一。研究发现,在急性脑缺血、帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统重大疾病中Akt通过抗凋亡机制促进神经元存活。动态观察SE后颞叶癫痫大鼠海马中Akt1蛋白的表达变化,以探讨其在癫痫发生发展中的作用。方法:选用健康成年S-D雄性大鼠210只,随机将实验动物分为正常组(10只)、licl组(10只)、癫痫组(190只)。致痫组使用氯化锂-匹罗卡品化学诱导,当大鼠痫性发作达V级,1小时后腹腔给予硫酸阿托品和地西泮解除痫性发作。licl组仅腹腔注射氯化锂3mEq/kg,对照组以相同液体量的生理盐水取代氯化锂和毛果芸香碱。正常组、licl组、癫痫持续状态后不同时间点(0h、1h、6h、12h、24h、48h、7d、10d、30d、50d)分别提取海马组织总蛋白和获取大鼠脑组织切片。利用免疫印迹技术对海马组织总蛋白进行检测,常规配制凝胶,进行上样,每个孔道加入等量蛋白,进行电泳,转膜和封闭后一抗4℃过夜,二抗孵育,最后应用凝胶成像系统化学发光。Quantity one软件进行灰度值分析,Akt1蛋白相对灰度值采用方差分析进行统计学分析。免疫组织化学技术检测AKT1在海马组织中表达,切片常规脱腊至水,3%H2O2阻断内源性过氧化氢酶,水浴加热法抗原修复,正常山羊血清封闭,各自分别滴加抗体AKT1,置于湿盒内4℃过夜。滴加生物素标记羊抗兔IgG,37℃湿盒孵育,滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃湿盒孵育。DAB室温下显色,苏木精染核,盐酸酒精分化,氨水返蓝,常规脱水,透明,封片。光镜下观察,阳性细胞为胞浆黄染,胞核呈淡蓝色。对切片中海马结构区域的免疫组化显色阳性的神经细胞定量,采用显微计数法(200×)。免疫组织化学结果采用方差分析进行统计学处理。检验水准α=0.05,数据使用SPSS17.0统计软件包进行分析。结果:1.利用免疫印迹实验分别对正常对照组、licl组、致痫组海马中Aktl蛋白进行检测。实验结果显示:SE后0h、24h、30d与正常对照组Akt1蛋白表达相对灰度值比较差异有统计学意义,p值分别为0.034、0.000、0.002。SE后1h、6h、12h、48h、7d、10d、50d与正常对照组Akt1蛋白表达相对灰度值比较差异无统计学意义,p值分别为0.565、0.093、0.053、0.089、0.922、0.933、0.355。SE后1h、6h、12h、24h、48h与licl组Akt1蛋白表达相对灰度值比较差异有统计学意义,p值分别为0.034、0.002、0.010、0.000、0.002。SE后0h、7d、10d、30d、50d与licl组Akt1蛋白表达相对灰度值比较差异无统计学意义,p值分别分0.557、0.096、0.137、0.097、0.511。licl组与正常组Akt1蛋白表达相对灰度值比较差异无统计学意义,p值为0.117。结果提示:癫痫组与正常对照组相比,在SE开始时和SE后30天Akt1蛋白在海马中的表达明显增加,达峰值(0h=0.49,30d=0.52),在SE后24小时表达明显减少,迅速降至最低水平并且低于正常(24h=0.27),其余时间点Akt1蛋白在癫痫组海马中的表达无明显改变。癫痫组与licl组比较,在SE后1小时开始降低,于24小时降至最低水平(24h=0.27),48小时开始增加,于SE后7天增加至licl组水平。2.利用免疫组织化学技术对海马区AKT1蛋白表达进行研究,Akt1蛋白主要表达在海马区锥体细胞胞浆内,呈现棕黄色颗粒,使用显微镜(200×)对海马CA3、CA2和CA1区Akt1蛋白分别进行计数。海马CA3区SE后0h、1h、6h、12h、24h、10d、30d、50d组与正常对照组比较差异有统计学意义,p值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000。海马CA3区SE后48h、7d与正常对照组比较差异无统计学意义,p值分别分0.368、0.064。海马CA3区SE后0h、1h、6h、12h、24h、48h、7d、30d、50d组与licl处理组比较差异有统计学意义,p值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.000。海马CA3区SE后10d与licl处理组比较差异无统计学意义,p值为0.822。海马CA3区licl处理组与正常对照组比较差异有统计学意义,p值为0.000。海马CA1区及CA2区癫痫组、licl处理组、对照组比较差异无统计学意义(p>0.05)。结果提示:①大鼠癫痫持续状态后,Akt1蛋白在癫痫组海马CA3区细胞中表达立即开始增加,12小时达高峰(46.7±2.9),48小时回到正常对照组水平(16.2±2.5),10天再次开始增加(25.0±2.3),30天二次达高峰(44.1±1.8),50天开始恢复(22.3±2.6)。②licl组CA3区Akt1蛋白表达较正常组及癫痫后0小时组增加,差别有统计学意义(p<0.05)。③在正常对照组、licl组、癫痫组间Akt1蛋白在CA1和CA2区细胞中表达无明显区别,差别无统计学意义(p>0.05)。结论:1.在SE开始时和SE后30天Akt1蛋白在海马中表达明显增加,在SE后1天Akt1蛋白在海马中表达明显减少,其在海马中表达水平呈现先增多后降低,后期再度升高的动态改变。2.Akt1蛋白主要在海马CA3区锥体细胞胞浆表达,CA1、CA2区也有少量表达。3.海马CA3区Akt1蛋白表达在SE后先增多后降低,再增多后降低,由此可推断Akt1蛋白可能对神经元起到保护作用。