论文部分内容阅读
蕙兰(Cymbidium faberi),花姿秀丽,香味浓郁,具有很高的观赏价值。利用基因工程技术培育出新的花卉品种,是世界观赏园艺植物育种的主要研究热点之一。迄今为止,已经分离和克隆了许多观赏植物相关的花器官发育基因,但是关于蕙兰的研究鲜有报道。本研究以蕙兰为试材,通过同源克隆和RT-PCR,以TUA、TUN、ACT、GAPDH、18S rRNA、UBQ、EF1a作为候选基因,用绝对定量的方法进行内参基因的筛选,再结合RACE技术,从花葶中成功分离了蕙兰CfAP11、CfMADS1花发育相关基因的cDNA全长,并通过相对荧光定量PCR的方法,对这些基因在不同器官及不同发育过程中的时空表达特性进行了分析。同时,构建了CFAP11基因的正义、反义植物表达载体,转化烟草,经过RT-PCR、Southem blot鉴定检测后,得到部分阳性植株。主要研究结果如下：1.以TUA、TUB、ACT、GAPDH、18S rRNA、UBQ、EF1a作为候选基因进行克隆,绝对定量表达分析后利用GeNorm、Normfinder进行分析,并进行功能基因的进一步验证。综合内参基因筛选的分析,对所有时期所有器官来说,可以选用ACT、UBQ3和GAPDH三个内参基因同时作为内参用于蕙兰其他功能基因相对表达水平的研究,可以得到相对准确的差异表达结果；对于营养期,可选用两个内参基因UBQ2和UBQ3进行基因表达的归一化处理；对于花蕾期,选用ACT和UBQ3即可进行功能基因的表达分析；对于盛花期,在进行归一化处理功能基因的相对差异表达时可以引入ACT、UBQ3和UBQ2三个内参基因；对于营养器官,宜用UBQ2和ACT两个内参基因；对于生殖器官,宜用ACT、UBQ3和UBQ2三个基因做内参进行数据处理；对于根,可用两个基因UBQ2和ACT做为内参；对于叶,可用两个基因ACT和UBQ3同时作为内参进行数据的分析；对于葶,宜用两个基因ACT和UBQ2作为内参即可；对于花,ACT和UBQ2同时作为花器官不同组织的内参基因时基因表达分析较为准确。2.根据NCBI已知基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR并结合RACE的方法,从蕙兰的花葶中成功获得了2个花器官发育相关基因,分别命名为CfPll、CfMADS1, GenBank登录号分别为：JQ031272、KC148540。序列分析表明,这两个基因均含有MADS结构域和植物所特有的K结构域,属于MADS-box基因家族。CfAP11没有C末端保守基序,CfMADS1有C末端保守基序LPPWML。经过生物信息学分析表明,二者均属于不稳定的亲水性蛋白,三级结构相似。3.采用相对荧光定量的方法对花发育相关基因CfAP11、CfMADS1在蕙兰不同时期不同器官的时空表达特性进行分析表明,不同的基因在不同时期不同器官中有不同的表达模式,具有一定的组织特异性。CfAP11在营养期叶中表达较为强烈,可能与花的诱导有关。在花蕾期叶中中度表达,根中表达很弱。很显著的是,CfAP11基因在盛花期子房和花葶中高度积累,其表达水平明显增加,很可能CfAP11基因与蕙兰果实的形成关系密切,且通过花葶向子房中积累,逐渐形成果实。CfMADS1在营养期叶、根和花蕾期叶器官均有表达,表明该基因与花的诱导和花的起始有关；在花蕾期葶、花蕾中都有较高水平的表达,这可能与花器官的发育和花器官的形成有关,也可能花蕾中该基因的部分mRNA是通过花葶运输而进行表达的；在盛花期叶中高度表达,葶中表达水平也较高,说明盛花期该基因与前两个时期相比得到了较高水平的表达；盛花期子房中也有一定水平的表达,说明该基因以某种机制参与蕙兰果实的形成。4.成功构建了CfAP11基因的正义、反义植物表达载体,采用叶盘转化法转化烟草,经基因组PCR检测和Southern blot鉴定,初步得到部分阳性植株。