莲抗氧化系统重要基因的克隆和表达分析

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莲是我国的重要的水生蔬菜,具有很大的经济和观赏价值,我国很早就开始利用莲的食用价值和药用价值。目前人们已经从莲的分类学、形态学、生理学、药物学等方面进行了深入的研究。作为一种重要的经济作物,关于莲分子克隆和转基因等方面的研究却比较匮乏,抗氧化酶(MnSOD、CuZnSOD、APX和CAT等)可以清除体内的活性氧离子(ROS),以延缓机体的衰老和增强植物的抗逆性。本文克隆得到了几个重要的莲抗氧化基因,分析了这些基因的表达特点,这些基因的克隆和表达分析可以为转基因的研究提供优良的候选基因。主要包括4个方面的内容:1.莲MnSOD基因的克隆和表达分析SOD可以清除机体内的超氧离子,是抗氧化系统中的第一个酶。按照其结合的金属离子和亚细胞定位,可以分为3种不同的类型:MnSOD、CuZnSOD和FeSOD。我们克隆得到了一个926 bp的莲MnSOD cDNA全长,序列分析表明MnSOD的外显子在进化的过程中极其保守。莲MnSOD的高级结构具有MnSOD家族的普遍特征。体外表达的莲MnSOD蛋白具有很强的热稳定性,在35-50℃处理半小时后仍能保持90%以上的酶活性。莲MnSOD基因在不同的部位表达差异显著,短期机械损伤和温度胁迫可以诱导莲MnSOD基因的表达。2.莲CuZnSOD基因的克隆和表达分析我们克隆得到了两个莲CuZnSOD cDNA全长,CuZnSOD1和CuZnSOD2的全长分别为723 bp和713 bp。莲CuZnSOD的高级结构具有CuZnSOD家族的普遍特征。通过比较莲CuZnSOD1和CuZnSOD2蛋白的结构推测它们具有相同的酶活性。体外表达的莲CuZnSOD蛋白具有很强的热稳定性,在35-65℃处理半小时后仍能保持90%以上的酶活性。亚细胞定位实验表明莲CuZnSOD蛋白定位于细胞质和细胞核内。我们首次系统的归纳了三种类型的CuZnSOD(叶绿体CuZnSOD、细胞质CuZnSOD和胞外CuZnSOD)在转录本个数、末端氨基酸、氨基酸长度和亚细胞定位之间的差异。莲CuZnSOD基因在不同的部位表达差异显著,短期机械损伤和高温胁迫可以诱导莲CuZnSOD基因的表达。3莲APX基因的克隆和表达分析APX是POD蛋白家族的一种,它可以利用抗坏血酸作为电子供体把H2O2还原为H2O。我们克隆得到了一个1379 bp的莲APX cDNA全长,序列分析表明高等植物APX蛋白的同源性很高。体外表达的莲APX蛋白具有APX蛋白酶活性(0.04 mM ascorbate min-1 mg-1 protein),在100℃处理半小时后,仍能保持20%以上的酶活性。莲APX基因在不同的部位表达差异显著,短期机械损伤可以诱导莲APX基因的表达。4莲CAT基因的克隆和表达分析我们克隆得到了一个1666 bp的莲CAT cDNA全长,序列分析表明植物CAT蛋白的同源性很高。莲CAT基因在不同的部位表达差异显著,研究表明莲抗氧化基因(MnSOD、CuZnSOD、APX和CAT)在面对短期机械损伤时具有协同作用。
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