参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,从我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱肠道和唾液腺研磨物中提取总RNA,利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA并采用PCR技术扩增获得了Bm91基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行PCR、酶切和测序分析鉴定,其大小为1908 bp。结果表明所克隆的Bm91基因与GenBank上已登录的Bm91基因的核苷酸序列的同源性为97.1%,氨基酸序列的同源性为97.5%,该片段含有完整的开放阅读框。将该基因从克隆载体上用EcoRⅠ单酶切消化并亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pP1C9K的EcoRⅠ酶切位点,再次进行PCR、酶切和测序分析鉴定,成功构建并获得了微小牛蜱Bm91基因的重组真核表达载体pP1C9K-Bm91。该重组体pP1C9K-Bm91用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,并在MD培养基平板上置28℃培养2-4d,挑取单克隆菌落转化子经PCR反应证实目的基因已整合到毕赤酵母中。将PCR检测为阳性的重组克隆采用影印法依次接种到含G418浓度梯度为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL的YPD培养基中,逐级筛选G418抗性菌株即目的基因高拷贝重组菌株并命名为GS115/pPIC9K-Bm91 His+Mut+。然后将所得到的高拷贝重组菌株用0.5%甲醇诱导表达96 h。诱导产物通过SDS-PAGE和Western印记法分析表明:表达产物中出现了与预测分子量大小一致的83 ku左右的蛋白条带,且能很好的被兔抗微小牛蜱阳性血清识别,说明此表达蛋白具有良好的免疫学活性,这为研制微小牛蜱的分子疫苗奠定了基础。