论文部分内容阅读
几丁质由N-乙酰氨基葡萄糖残基通过β-1,4糖苷键结合而成的直链多聚物,是昆虫外骨骼、肠道、气管及围食膜等的主要组成成分。昆虫几丁质酶是一种能够将几丁质水解成为寡聚物的内切酶,广泛存在于昆虫的中肠、蜕皮液及某些昆虫的毒腺中,在昆虫的生长发育过程中精确的调节着几丁质的代谢。目前,昆虫几丁质酶主要应用在病虫害防治、疾病控制及几丁质生物垃圾的降解等方面。
本研究首次将金纹细蛾Ⅰ型几丁质酶(LrCHT5)基因分别构建到原核表达载体pRSET-C、pET28a、pET32a及pMAL-s上,进行原核载体的筛选,期望能够获得表达可溶性蛋白的载体。利用分子生物学常规实验方法构建重组载体,将其分别转化到相应的表达感受态中,利用IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析结果表明构建的重组BL-pET28a-LrCHT5及BL-pET32a-Lr CHT5表达的蛋白以包涵体形式存在,重组BL-pRSET-LrCHT5没有表达出目的蛋白,重组BL-pMAL-LrCHT5表达出110kDa左右的可溶性融合蛋白MBP-Lr CHT5。Western blot检测结果进一步证明重组BL-pMAL-LrCHT5菌表达出可溶性融合蛋白。为了使融合蛋白能够高效表达,本研究对重组pMAL-LrCHT5菌液的表达条件进行优化,最佳表达条件最终优化为菌液OD值为0.778,诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导的过程中采用16℃过夜诱导。对于表达的MBP-LrCHT5蛋白采用4℃与Amylose柱过夜结合进行纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化出纯度较高的MBP-LrCHT5融合蛋白。利用胶状几丁质及4MU-(GlcNAc)3作为底物均未检测到活性。
由于重组BL-PMAL-LrCHT5表达的融合蛋白MBP-LrCHT5在纯化的过程中及生物学活性方面存在问题,本研究将LrCHT5基因构建到载体pFastBacTMDual上,进一步转化入DH10Bac感受态中,获得重组穿梭载体Bacmid-LrCHT5,利用脂质体介导转染Sf9细胞并进行细胞表达。由于LrCHT5本身含有信号肽区,所以在表达的过程中分泌到细胞培养液中。表达结束后,对培养液进行收集透析,利用Ni-NTA柱进行蛋白分离纯化,SDS-PAGE电泳分析结果显示纯化得到单一条带的纯化蛋白。
本研究对原核和Sf9细胞表达的目的蛋白进行酶学活性检测。利用4MU-(GlcNAc)3作为底物,结果显示,原核表达的融合蛋白不具酶学活性,Sf9细胞表达的目的蛋白的比活力为2.917U/μg,最佳温度为50℃左右,最佳pH为6.0。高浓度的金属离子Mn2+、Ca2+、Mg2+及Ba2+对LrCHT5蛋白具有不同程度的促进作用,Cu2+对酶有较强的抑制作用,SDS酶的抑制作用最强。通过对LrCHT5蛋白的动力学参数测定结果显示Km为14.2μm/L,Vmax值为0.905μM/min。另外,对纯化的LrCHT5蛋白进行抑菌实验研究,结果表明LrCHT5蛋白对青霉及酵母分别存在不同程度的抑制作用。本课题深入研究了LrCHT5的生化性质,为LrCHT5功能研究奠定了基础,同时为金纹细蛾的生物学防治提供理论依据。