代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产手性2,3-丁二醇及乙偶姻

来源 :天津大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:bobo20092009
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2,3-丁二醇和乙偶姻作为重要的平台化合物,在食品、医药、能源和其它行业具有广泛应用。谷氨酸棒状杆菌是非致病性的革兰氏阳性菌,氧气充足的条件下菌体密度较高,底物消耗快,产物生产率较高。本文从野生型Corynebacterium glutamicum ATCC 13032和敲除了ldhA、pta、ack基因的菌株SAT7出发,经过代谢工程改造,使谷氨酸棒状杆菌具有生产两种手性2,3-丁二醇和乙偶姻的能力。为消除谷棒自身butA基因的影响,重点考察人工引入基因的功效,首先敲除butA得到WT△butA/SAT7△butA。进而引入B.subtilis 168乙偶姻合成途径alsSD操纵子,得到乙偶姻生产菌株CGF3-10。为生产D-2,3-丁二醇而引入B.Subtilis 168的D-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因bdhA,构建菌株CGF11-18;为生产meso-2,3-丁二醇而引入K.pneumoniae的meso-2,3-丁二醇脱氢酶编码基因budC,构建菌株CGF19-26。最后,为探究谷棒自身的编码meso-2,3-丁二醇脱氢酶的基因butA的作用,构建过表达载体,得到菌株CGF27-28。利用辅因子工程调节菌株胞内的氧化还原力。Lactobacillus brevis CICC 6239的nox基因,编码合成的NADH氧化酶使NADH氧化为NAD+,理论上可为细胞提供乙偶姻合成所需氧化力。E.coli W1485的udhA基因,编码合成的还原力平衡过程转氢酶可使磷酸戊糖途径中合成的NADPH转化为NADH,理论上可提高2,3-丁二醇合成所需还原力。通过对工程菌株在不同培养基中的发酵表征,证明了谷氨酸棒状杆菌能够有效合成2,3-丁二醇和乙偶姻。CGF5,在丰富培养基中经过50 h时消耗20 g/L葡萄糖,生产了5.94 g/L乙偶姻,达到理论最大得率的60%,具有0.12 g/Lh生产力。CGF18,在基本盐培养基中经过30 h生产了4.65 g/L D-2,3-丁二醇,达到理论最大得率的46%,生产力0.15 g/Lh。CGF28,在添加了0.5%酵母抽提物的基本盐培养基中经过30 h获得了4.73 g/L的meso-2,3-丁二醇,生产力为0.16 g/Lh,达到理论最大得率的47%。实验证明,谷氨酸棒状杆菌具备良好的2,3-丁二醇和乙偶姻合成能力。编码合成D-2,3-丁二醇脱氢酶的外源基因bdhA在谷氨酸棒状杆菌表达效果良好。而编码合成meso-2,3-丁二醇脱氢酶的外源基因budC,表达效果不如谷棒本身具有的butA基因。
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