【摘 要】
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酶固定化技术的开发和应用己成为生物技术的重要研究内容之一。酶的固定化技术是将游离酶固定在载体中,打破游离酶对环境敏感、性质不稳定、易失活等局限性,实现提高其化学稳定性、热稳定性以及可回收重复利用的过程。其中固定化酶的载体、固定化方法均是影响固定化技术的重要因素。近年来,金属有机框架材料（Metal-organic frameworks,MOFs）被广泛应用于酶固定化技术中,MOFs材料具有高比表面
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酶固定化技术的开发和应用己成为生物技术的重要研究内容之一。酶的固定化技术是将游离酶固定在载体中,打破游离酶对环境敏感、性质不稳定、易失活等局限性,实现提高其化学稳定性、热稳定性以及可回收重复利用的过程。其中固定化酶的载体、固定化方法均是影响固定化技术的重要因素。近年来,金属有机框架材料（Metal-organic frameworks,MOFs）被广泛应用于酶固定化技术中,MOFs材料具有高比表面积,易调整的孔径,易修饰性结构和合成条件温和等特点。但其单一结构仍限制了其应用,会出现酶易失活、酶易浸出等问题。因此,对MOFs材料进行修饰、改性和与其他材料复合制备新型载体材料用于固定化酶是良好的研究策略。本课题利用不同的方法制备了 MOFs复合载体材料,并将辣根过氧化物酶固定在载体材料上。通过XRD、SEM、FTIR、XPS、TG、BET、VSM等表征手段对载体的形貌和结构进行表征,进一步研究了酶固定化的机理和固定化酶的酶学性质。利用固定化酶氧化降解水中的苯酚,探究固定化酶的催化氧化性能。具体内容如下:（1）通过水热法制备了 CS@MIL-101（Cr）复合材料,利用吸附法和戊二醛交联结合法固定化酶。经研究发现,固定化后的酶相对游离酶环境适应性更强,在高温条件和碱性条件下固定化酶优于游离酶。另外还对比了的单一的MIL-101（Cr）固定化酶。其中CS@MIL-101（Cr）复合材料表现出明显的优势。对1 mg/mL的辣根过氧化物酶溶液固载率可达89%,最佳温度为40℃,最佳pH为7。保存10天后相对酶活性仍可达70%,105U/mg。在使用4次后,相对酶活性仍达到50%。在40℃、pH=7,苯酚浓度较低时固定化酶对苯酚的催化率为95%。（2）通过水热制备了氨基功能化的CS-NH2-MIL-101（Cr）复合材料并在相同的条件下进行固定化酶以及酶学性质研究的实验。在相同的条件下,功能化后的材料性能更优于CS-MIL-101（Cr）。在相同条件下,CS-NH2-MIL-101（Cr）载体的固定化酶量更多,环境耐受性更好热稳定性更强。半衰期为15天,使用四次后仍保持55%的相对活性。CS-NH2-MIL-101（Cr）固定化酶较CS-MIL-101（Cr）固定化酶更耐高温、受苯酚浓度影响小、在40℃、pH=7苯酚的除去率更高为96%。（3）以水凝胶为模板,采用模板乳化法制备锌基MOF材料HZIF-8,利用包埋法和交联法相结合的方法固定辣根过氧化物酶,进一步提高了载酶量,固载率为92%。固定化酶的操作稳定性和酶活性显著增强。固定化酶的最适温度提高到50℃,最适pH为7,但HZIF-8固定化酶的环境耐受力远高于游离酶。HZIF-8固定化酶的半衰期为16天。当固定化酶放置10天时,相对酶活性仍然达到82%,124.64 U/mg。重复回收使用6次,相对酶活仍达到50%以上。HZIF-8固定化酶最佳降解条件:50℃、pH=8。HRP与HZIF-8固定化酶的Km值分别为9.57mmol/L,5.69 mmol/L。HZIF-8固定化酶对底物的亲和力高于游离酶,其催化效率相对游离HRP有所提升。（4）通过溶剂热法将Fe3O4纳米颗粒引入MIL-100（Fe）晶体中制备了既具有磁性还具有介孔的复合材料Fe3O4-MIL-100（Fe）载体材料。游离辣根过氧化物酶的最适温度为40℃,Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶的最适温度提高到50℃。游离酶的最适pH为7,Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶的最适pH为8,与游离相比较Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶的适用pH范围更广。Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶的半衰期为15天,储存稳定性较好。当在保存20天后,活性仍然为37%,56.24 U/mg。在使用7次后,Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶仍还保持50%的相对活性,Fe3O4-MIL-100（Fe）固定化酶对苯酚的催化率高达97%。Fe3O4-MIL-100（Fe）采用磁分离具有简便、快速的优点,在一定程度上避免了酶在一定条件下的脱落现象。
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