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目的通过建立人乳腺癌细胞与人成纤维细胞体外共培养模型和人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤模型,从体外实验研究共培养的成纤维细胞Caveolin-1与共培养的乳腺癌细胞B-cell lymphoma-2（Bcl-2）和Tumor protein 53?induced glycolysis and apoptosis regulator（TIGAR）表达的相关性及对癌细胞凋亡的影响,从体内研究乳腺癌组织Caveolin-1的表达与Bcl-2和TIGAR表达的关系,为乳腺癌的分子靶向治疗提供理论和实验依据。方法1.细胞培养和共培养人成纤维细胞株CCC-ESF-1（ESF）细胞和人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞分别加入含有10%胎牛血清的DMEM-H培养基在培养箱中培养,培养箱条件为37℃,5%CO2,饱和湿度,隔天换液,待细胞生长至80%～90%汇合时,进行传代培养。采用六孔板和Trans-well小室对ESF细胞和MDA-MB-231细胞进行体外共培养,用于检测ESF细胞Caveolin-1的表达,MDA-MB-231细胞Bcl-2和TIGAR的表达。2.RT-qPCR用Trizol法提取细胞总RNA,测量并观察A260/A280比值及连续波长吸收峰,判断RNA提取的RNA质量。逆转录合成c DNA,-20℃保存c DNA。PCR扩增反应,40个循环,熔解曲线65℃～95℃。实验结果由荧光定量PCR分析软件Bio-Rad CFX Manager自动进行统计和计算。3.Western-Blot洗涤和收集培养的细胞,加入细胞裂解液,根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书配制蛋白标准品,绘制标准曲线。聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,每泳道20μg蛋白质,转移缓冲液转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭,一抗孵育4℃过夜,洗涤后加入二抗,ECL显色,Image J软件分析各条带光密度。4.建立荷瘤裸鼠乳腺癌模型取100μL细胞悬液（细胞浓度:2×10~6MDA-MB-231细胞,1×10~6ESF细胞）植入6-7周的雌性裸鼠右侧胸壁乳腺内,每隔1天用游标卡尺测量瘤体的最长径（a）和最短径（b）,根据公式计算肿瘤体积,肿瘤的体积计算公式:V（mm3）=1/6πab2,以肿瘤长径达5 mm为成瘤（约细胞接种后7-10天）。植入的第三十天将裸鼠颈椎脱臼处死,将肿瘤组织块放入10%福尔马林固定液中固定。5.细胞凋亡实验?Annexin V实验收集细胞,每一实验样本细胞数量为1×10~6,用Annexin V-Biotin孵育细胞15 min,再用Streptavidin-FITC孵育细胞15 min。加入7-amino-actinomycin（7-AAD）用于区别凋亡细胞与其他死细胞,流式细胞仪检测。?caspase3活性荧光检测提取细胞蛋白,实验设空白对照孔和待测样品孔,均加入含荧光底物AC-DEVD-AMC的Caspase-3反应缓冲液,空白孔加细胞裂解液,待测样品孔加细胞总蛋白,荧光分光光度计检测AMC释放量,分析荧光强度。6.免疫荧光实验荷瘤裸鼠肿瘤组织进行石蜡包埋做成切片,切片脱蜡后进行免疫荧光实验。主要步骤如下:加0.01M枸橼酸缓冲液（p H 6.0）,入微波炉修复抗原,1%BSA 37℃封闭30 min,滴加一抗4℃孵育过夜,室温平衡30min,滴加荧光二抗,37℃孵育避光60 min,封片。激光共聚焦显微镜下观察,拍照,Image-Pro Plus软件分析荧光强度。7.免疫组化实验切片脱蜡至水,用3%H2O2,37度孵育10min,入微波炉修复抗原,37℃封闭30 min,滴加一抗4℃孵育过夜,滴加对应二抗,37℃避光孵育30 min,DAB显色,苏木素复染。显微镜下观察,拍照,Image-Pro Plus软件分析。8.统计学分析实验结果用mean±SD表示,SPSS Statistics 17.0软件处理实验数据,两组间均数比较采用t检验,P＜0.05为差异有显著性,P＞0.05为差异无显著性。结果1.ESF和MDA-MB-231细胞表达Caveolin-1的结果RT-q PCR和Western blot实验结果显示,ESF单独培养组Caveolin-1的m RNA和蛋白表达高于MDA-MB-231+ESF共培养组ESF细胞Caveolin-1的m RNA和蛋白表达（p＜0.05）,MDA-MB-231单独培养组Caveolin-1的m RNA和蛋白表达水平与MDA-MB-231+ESF共培养组MDA-MB-231细胞Caveolin-1的m RNA和蛋白表达水平相比较无显著性差异（p＞0.05）,说明乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养可下调成纤维细胞中Caveoin-1的表达,而对乳腺癌细胞中Caveolin-1的表达无显著影响。2.MDA-MB-231细胞表达抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的结果RT-q PCR和Western blot实验结果显示,MDA-MB-231单独培养组Bcl-2的m RNA和蛋白表达低于MDA-MB-231+ESF共培养组MDA-MB-231细胞Bcl-2的m RNA和蛋白表达（p＜0.05）,MDA-MB-231单独培养组TIGAR的m RNA和蛋白表达低于MDA-MB-231+ESF共培养组MDA-MB-231细胞TIGAR的m RNA和蛋白表达（p＜0.05）,说明乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养能上调乳腺癌细胞抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的表达。3.共培养对MDA-MB-231细胞凋亡的影响结果Caspase3活性荧光检测结果显示,MDA-MB-231单独培养组Caspase3活性水平高于MDA-MB-231+ESF共培养组MDA-MB-231细胞Caspase3活性水平（p＜0.05）。Annexin V–Biotin实验结果显示,MDA-MB-231单独培养组早期凋亡细胞多于MDA-MB-231+ESF共培养组的早期凋亡的MDA-MB-231细胞,说明乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养能抑制MDA-MB-231细胞凋亡。4.荷瘤裸鼠乳腺癌组织实验结果?HE染色证实为癌组织。?绿色荧光为Caveolin-1表达阳性,免疫荧光共聚焦显微镜观察显示MDA-MB-231组肿瘤组织出现较强的绿色荧光,MDA-MB-231+ESF组的肿瘤组织绿色荧光较弱,Image-Pro Plus软件分析荧光强度显示,MDA-MB-231组Caveolin-1的荧光强度与ESF+MDA-MB-231组Caveolin-1的荧光强度比较显著增强,说明乳腺癌细胞与成纤维细胞共生长下调Caveolin-1在人乳腺癌裸鼠移植瘤组织中的表达。?免疫组化结果显示,胞浆出现棕黄色颗粒为TIGAR和Bcl-2表达阳性,人乳腺癌荷瘤裸鼠乳腺癌组织表达TIGAR和Bcl-2。用Image-pro-plus软件分析TIGAR和Bcl-2免疫组化的光密度,结果显示MDA-MB-231+ESF组的乳腺癌组织切片TIGAR和Bcl-2表达的平均光密度值较MDA-MB-231组的乳腺癌组织切片TIGAR和Bcl-2表达的平均光密度值大（p＜0.05）。说明乳腺癌细胞与成纤维细胞在荷瘤裸鼠体内共生长能促进人乳腺癌荷瘤裸鼠移植瘤组织中TIGAR和Bcl-2的表达。5.临床人乳腺癌组织实验结果?HE染色证实为癌组织。?免疫组化光学显微镜观察,棕黄色颗粒为Caveolin-1表达阳性,用Image-pro-plus软件分析Caveolin-1免疫组化的光密度值,结果显示乳腺癌切片Caveolin-1的平均光密度值小于非乳腺癌切片Caveolin-1的平均光密度值（p＜0.05）,表明Caveolin-1在乳腺癌组织中的表达低于非乳腺癌组织中的表达。?免疫组化光学显微镜观察显示胞浆出现棕黄色颗粒为TIGAR和Bcl-2表达阳性,用Image-pro-plus软件分析免疫组化切片TIGAR和Bcl-2的光密度,结果显示乳腺癌切片TIGAR和Bcl-2的平均光密度值较非乳腺癌切片TIGAR和Bcl-2的平均光密度值大（p＜0.05）,表明TIGAR和Bcl-2在乳腺癌组织中的表达高于非乳腺癌组织中的表达。结论1.乳腺癌细胞与成纤维细胞体外共培养可下调成纤维细胞Caveoin-1的表达,而对乳腺癌细胞中Caveolin-1的表达无显著影响。2.乳腺癌细胞与成纤维细胞体外共培养能上调乳腺癌细胞中抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的表达,从而抑制MDA-MB-231细胞凋亡。3.乳腺癌细胞与成纤维细胞体内共生长能下调Caveolin-1在人乳腺癌裸鼠移植瘤组织的表达,且上调Bcl-2和TIGAR的表达。4.25例临床乳腺癌组织TIGAR阳性率80%,Bcl-2阳性率72%,Caveolin-1阳性率52%。5.乳腺癌相关的成纤维细胞Caveolin-1的表达与乳腺癌细胞TIGAR和Bcl-2的表达呈现负相关。