论文部分内容阅读
绞股蓝[Gynostemma pentaphllim(Thunb.)Makino]是葫芦科绞股蓝属植物,主要药用活性成分是绞股蓝皂苷(Gypenosides,Gyp),为四环三萜达玛烷结构。研究表明,Gyp具有抗衰老、抗氧化、降血脂、降血糖、增强免疫力、抑制肿瘤等功能。近年来,有学者报道Gyp能抑制多种肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞发生凋亡。本论文主要研究了 Gyp对人结直肠癌SW-480、SW-620细胞的增殖抑制、周期阻滞、细胞凋亡和迁移抑制的作用,并对其机制进行初步探讨;同时,对Gyp增强结直肠癌临床用药5-氟尿嘧啶(5-FU)的作用效果做了初步研究。研究结果为植物药用有效成分的抗肿瘤研究及开发积累相关资料。论文研究内容分三部分。首先,利用已建立的体外培养人结直肠癌SW-480、SW-620细胞系,研究Gyp对上述两种细胞的增殖抑制、诱导细胞凋亡和迁移抑制作用,实验检测了 Gyp对细胞周期阻滞的作用,细胞核形态学变化、DNA损伤作用,对细胞膜通透性影响、线粒体膜电位变化、活性氧生成量的变化、细胞形态及表面结构变化、细胞骨架的影响;其次,利用活性氧抑制剂NAC进一步研究活性氧在Gyp诱导肿瘤细胞凋亡中的作用,对细胞增殖的影响、细胞核形态学变化、DNA损伤、线粒体膜电位变化、活性氧产生的影响;第三,采用Gyp结合结直肠癌临床用药5-FU,初步研究其增强5-FU药用效果的作用,对细胞增殖的影响、细胞核形态学变化、DNA损伤、细胞凋亡的影响。目前获得的阶段性研究结果如下:1.Gyp对SW-480、SW-620细胞增殖抑制、凋亡诱导及迁移抑制作用对于体外培养的人结直肠癌SW-480、SW-620细胞,Gyp以剂量和时间依赖的方式抑制细胞生长,药物作用24 h的IC50值分别为91.77、108.81 μg/l。细胞周期抑制分析结果显示,Gyp对细胞周期进程的阻滞作用在不同细胞系中阻滞程度不同,对于SW-480细胞,阻滞在G0/G1期;SW-620细胞中无明显的周期阻滞作用。免疫荧光显微技术表明,Gyp作用细胞后,出现典型的细胞凋亡特征:核染色质固缩,形成碎片。PI冻染结合流式细胞仪分析显示,药物作用细胞后,出现DNA断片。流式细胞仪分别结合AnnexinV-PE/7-AAD荧光双染、PI、罗丹明123和DCFH-DA染色实验发现,Gyp诱导细胞发生凋亡、细胞膜通透性增强、线粒体膜电位下降、活性氧产生增加。鬼笔环肽-FITC标记观察细胞骨架变化发现Gyp影响细胞骨架肌动蛋白微丝的分布;扫描电子显微镜观察发现Gyp作用细胞后,细胞表面微绒毛减少;创伤修复实验说明Gyp可有效的抑制细胞的迁移运动能力。2.Gyp诱导SW-480、SW-620细胞凋亡的作用机制抑制剂阻断研究结果显示,活性氧抑制剂NAC可对抗Gyp对SW-480,SW-620细胞的增殖抑制作用;细胞核形态学观察及流式细胞仪分析表明,NAC的加入,可减弱由Gyp引起的DAPI(或Hoechst33342)荧光染色的增强、DNA断片生成量的增加,解除Gyp诱导的细胞凋亡;NAC可缓解Gyp对SW-480,SW-620细胞的迁移抑制作用;加入NAC后,SW-620细胞中Gyp诱导的线粒体膜电位的降低在一定程度上被抑制,但对于SW-480细胞无明显作用,说明对于SW-480细胞,线粒体损伤可能是活性氧生成的上游事件;而SW-620细胞中,ROS是引发细胞线粒体膜电位下降的原因。3.Gyp增强5-FU对人结直肠癌SW-620细胞的抗癌效果实验首先检测了单独5-FU对SW-620细胞的增殖抑制作用,各药物浓度间差异不显著,24 h细胞抑制作用不明显;联合Gyp后,对SW-620细胞的毒性作用明显增强,后续实验选择5-FU浓度为10 μg/ml和Gyp为70 μg/ml。流式细胞仪结合Annexin V-PE/7-AAD双染实验发现联合药物作用于SW-620细胞后,凋亡率增强,且相应的凋亡形态学特征明显,如细胞核固缩等。彗星电泳实验及DNA片段化实验检测发现,联合药物对细胞DNA的损伤比单独用药的作用显著。结论:Gyp对人结直肠癌SW-480、SW-620细胞的抗肿瘤作用明显,其机制可能为Gyp诱导产生的活性氧导致细胞DNA损伤,并引发线粒体膜电位下降,线粒体损伤释放凋亡因子,引起细胞凋亡发生;通过诱导细胞骨架系统重排抑制细胞迁移;增强5-FU对细胞的DNA损伤作用,从而增强5-FU对SW-620细胞的作用效果。