内生菌诱导人参不定根中皂苷生物合成及人参皂苷生物转化研究

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人参的不定根培养耗时短,成本低,但人参不定根内的次级代谢产物—人参皂苷的种类少、含量低。本研究利用人参内生菌作为诱导子提高了人参不定根的皂苷含量;运用土壤中的高效活性菌株对人参不定根进行发酵,提高了不定根中稀有人参皂苷的含量,旨在探索一条简便可行的、亲环境、低成本、高效生产稀有皂苷的新途径。本研究将人参不定根与园参中所含皂苷种类及含量进行了对比分析。分析及结果表明园参含有人参皂苷Rh1,Rb1,Rb2,Rd,F2,而人参不定根只含有人参皂苷Rg1,Rb1,Rd,不定根中总皂苷含量远远低于园参。从人参土壤中分离纯化得到243种菌株,进一步采用Esculin-R2A琼脂培养基筛选出147种产β-葡萄糖苷酶菌株。其中,菌株K35显示出很强的转化人参主皂苷为稀有人参皂苷的能力。为了提高人参不定根中人参皂苷的含量,对其进行微生物转化实验,并探讨最佳转化条件,如培养基、pH和微生物发酵时间等。结果表明,菌株K35在LL液体培养基、pH值为7.0、发酵时间为9 d时,转化生成的CK含量最高。并且在最佳发酵条件的产物经HPLC分析结果表明,其稀有人参皂苷CK含量为0.253 mg/g。我们以HepG2为靶细胞评价人参不定根提取物发酵产物的抗癌活性。其结果,发酵人参不定根提取物能够有效抑制肝癌细胞HepG2细胞,导致HepG2肝癌细胞的存活率下降。发酵的人参不定根提取物和未发酵的人参不定根提取物的IC50值分别为1.24 mg/mL和1.67 mg/mL。本研究还从5年生人参中分离筛选出来了 36种人参内生菌,其中4种具有产β-葡萄糖苷酶的能力,其中内生菌LB 5-3被筛选出来作为诱导子加入到人参不定根培养过程中提高人参不定根中稀有人参皂苷的含量,并对诱导实验条件进行了优化。实验结果表明10%(v/v)接种量诱导6 d,人参不定根皂苷含量为2.026 mg/g是未经过诱导的人参不定根皂苷含量的4倍,其中人参不定根产生了稀有人参皂苷CK,在最佳诱导条件下CK的含量达到了 1.024mg/g。将人参不定根经人参内生菌LB 5-3与茉莉酸甲酯(MeJA)联合诱导后,结果表明联合诱导会增加人参不定根稀有人参皂苷的含量,但作用没有内生菌LB 5-3单独诱导的作用明显。我们以HepG2为靶细胞评价经活的内生菌LB 5-3诱导的人参不定根提取物的抗癌活性。其结果,经诱导的人参不定根提取物能够有效抑制肝癌细胞HepG2细胞,导致HepG2肝癌细胞的存活率下降。经诱导的的人参不定根提取物和未经诱导的人参不定根提取物的IC50值分别为0.94 mg/mL和 1.30mg/mL。利用分子生物学方法对微生物K35和LB 5-3进行了鉴定。测序结果表明,K35属于青霉菌属,内生菌LB 5-3属于高地芽孢杆菌属。
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