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大剂量应用水杨酸盐类药物常常导致患者耳鸣及可逆性听力损失。临床研究报道,急性应用水杨酸盐会导致患者耳声发射(otoacoustic emissions, OAEs)幅值呈可逆性降低。动物实验发现,单次大剂量应用水杨酸盐能可逆性减少啮齿类动物的自发性耳声发射(spontaneous otoacoustic emissions, SOAEs)并使其畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAEs)幅值降低。耳蜗形态学及电生理学研究表明,水杨酸盐类药物主要作用于耳蜗。通过减少耳蜗血供及外毛细胞(outer hair cells, OHCs)的能动性,最终引起听力损失。然而,在本课题组前期有关水杨酸钠耳毒性机理的系列研究中,我们发现：与急性注射水杨酸钠结果相反,长期重复注射水杨酸钠后,实验动物的DPOAE幅值呈可逆性升高。其具体机制尚不清楚。OAEs与耳蜗外毛细胞的主动运动密切相关,是耳蜗主动性的直接反映。已知哺乳动物OHC胞体能动性在耳蜗主动放大功能的产生机制中占主导地位。特异性表达于OHC侧壁上的驱动蛋白prestin是OHC电能动性的分子基础,其正常表达对于耳蜗的机械放大功能的维持起着重要的作用。研究发现Cl-是prestin电压感受器的主要启动因子,它与prestin蛋白的内部位点结合而控制prestin蛋白的构象改变从而启动OHC电能动性。因此OHC所处内环境中的C1-浓度的改变势必直接或间接的影响OHC的胞体能动性,最终影响耳蜗主动放大功能。关于长期注射水杨酸钠如何引起耳蜗主动性增强,我们提出如下假设：①长期注射水杨酸钠可能使OHC膜上prestin(mRNA和/或蛋白)的表达上调而增强OHC的电能动性；②水杨酸钠可能通过多种因素(如改变耳蜗内氯离子转运相关的通道或转运体的表达)作用,使OHC所处内环境中的Cl-浓度发生改变,导致OHC内Cl-浓度的上升。更多的Cl-和prestin结合,从而增强了OHC的电能动性。③水杨酸钠作用改变(增加)了prestin蛋白与Cl-亲和力的,因而使OHC的电能动性增强。Na-K-2C1协同转运体家族(Na-K-2Cl co-transporter family, NKCC)和K-Cl协同转运体家族(K-Cl co-transporter family, KCC)是两类重要的氯化物协同转运体家族。其对于维持细胞的容积、盐的跨上皮转运以及调节胞浆中的离子(尤其是Cl-)浓度的平衡起着重要作用。本课题在前期建立的耳蜗主动性改变动物模型的基础上,通过对急性及慢性注射水杨酸钠后大鼠耳蜗prestin基因mRNA及蛋白表达的检测；并进一步对该模型下耳蜗内环境中的氯化物协同转运体家族成员mRNA表达进行检测,以探讨急性及慢性注射水杨酸钠引起耳蜗主动性改变的机制。全文分为两个部分。第一部分水杨酸钠对大鼠耳蜗prestinmRNA及蛋白表达的影响我们运用前期建立的水杨酸钠致耳蜗主动性改变的动物模型,对急性及慢性水杨酸钠肌注后大鼠耳蜗prestin基因mRNA及其蛋白表达的变化进行检测,以探讨急性,尤其是慢性注射水杨酸钠引起耳蜗主动性改变的可能机制。将48只成年健康Wistar大鼠随机分为A慢性组、B正常对照组、C急性组、D慢性恢复组四组,每组12只。各组大鼠断头处死后迅速剥离耳蜗；采用基于Taqman探针的荧光实时定量PCR的方法,检测各组大鼠耳蜗OHC prestin基因]mRNA的表达变化；运用Western-Blot技术分析prestin蛋白的表达变化。荧光定量PCR结果显示：慢性组prestin基因mRNA表达水平高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05),prestin基因mRNA水平上调2.25倍；急性水杨酸钠注射组prestin基因mRNA表达量水平与正常对照组比较,差异无统计学意义(p>0.05)；慢性注射水杨酸钠后恢复14天,大鼠耳蜗中prestin基因mRNA表达水平与正常对照组差异无统计学意义(p>>0.05)。Western-Blot检测结果显示：慢性组prestin蛋白表达高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)；与正常组相比,急性组和慢性恢复组prestin蛋白表达改变无统计学意义(p>0.05)。结果表明,急性注射水杨酸钠注射对耳蜗prestin基因的表达无影响；长期注射水杨酸钠使耳蜗prestin基因表达可逆性上调可能是其引起DPOAE的幅值增加的主要原因,推测也极可能是水杨酸钠在OHC水平致耳鸣的重要机制。第二部分水杨酸钠对大鼠耳蜗氯化物协同转运体NKCC及KCC家族表达的影响1.氯化物协同转运体NKCC及KCC家族在正常大鼠耳蜗中表达选取14只正常成年Wistar大鼠适应性饲养1周,分别设计针对NKCC及KCC家族各成员基因的特异性引物,采用逆转录PCR技术检测其在大鼠耳蜗中的表达情况,并设立阳性对照。其中KCC2基因选取同一只大鼠的脑组织做为阳性对照,KCC1、KCC3-4、NKCC1-2基因选取同只大鼠的肾组织做阳性对照。并进一步运用免疫组织化学技术,对神经元特异性KCC2蛋白在耳蜗中的表达作进一步观察和验证并探讨其存在的意义。结果显示：NKCC1的引物在大鼠的耳蜗和肾脏均产生401bp的PCR产物；NKCC2的引物仅在大鼠肾组织产生408bp的PCR产物,在耳蜗中未见相应的产物；KCC1的引物在大鼠的内耳和肾脏产生314bp的PCR产物；KCC2的引物在大鼠的内耳和脑产生268bp的PCR产物；KCC3的引物在大鼠的内耳和肾脏产生128bp的PCR产物,KCC4的引物在大鼠的内耳和肾脏产生246bp的PCR产物。免疫组织化学技术结果显示,KCC2蛋白在耳蜗螺旋神经节及盖膜表达为阳性；在内外毛细胞和支持细胞、血管纹及螺旋韧带神经纤维上有弱表达。上述结果提示,NKCC1及KCC1-4在维持耳蜗内环境中CI-的稳定起着一定的作用。2.水杨酸钠对大鼠耳蜗NKCC1及KCC1-4表达的影响将24只成年健康Wistar大鼠随机分为慢性组、正常对照组、急性组、慢性恢复组四组(每组6只)。各组大鼠断头处死后迅速剥离耳蜗；采用基于Taqman探针的荧光实时定量PCR的方法,选用28sRNA为内参照,检测各组大鼠耳蜗NKCC1及KCC1-4mRNA的表达情况。荧光定量PCR结果显示：长期大剂量水杨酸钠作用后NKCC1及KCC2 mRNA表达相对正常对照组增加,差异有统计学意义(p<0.05)；KCC3和KCC4 mRNA表达均低于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)；KCC1mRNA表达与正常对照组间差异无统计学意义(p>0.05)。急性水杨酸钠作用后KCC1mRNA表达相对正常对照组上调,差异有统计学意义(p<0.05);NKCC1、KCC2-4 mRNA表达均较正常组下调,差异有统计学意义(p<0.05)。表明急性及慢性注射水杨酸钠可能通过影响耳蜗内环境中的KCC1-4、NKCC1mRNA等多种转运体的表达而引起内淋巴液中Cl-浓度的改变,从而间接影响外毛细胞内Cl-浓度,最终影响耳蜗主动性。综上所述,可以认为长期注射水杨酸钠通过以下途径使耳蜗主动性增加：①长期注射水杨酸钠使特异性表达手耳蜗OHC的驱动蛋白prestin表达上调,从而引起OHC能动性增加,最终导致耳蜗主动性增加；②长期注射水杨酸钠能够引起氯化物转运体家族多个成员mRNA表达的改变。多种因素的共同作用可能使OHC所处内环境中的Cl-浓度发生改变,最终导致OHC胞内的Cl-浓度增加而使耳蜗主动性增加。