论文部分内容阅读
烟草是我国重要经济作物,植株的生长发育直接关系到烟叶的品质。油菜素内酯（BRs）是一种重要的、对植物生长发育有着多方面调控作用的激素。油菜素内酯受体BRI1是一个单次跨膜的富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶（leucine-rich repeat receptor-like protein kinase,LRR-RLKs）,该蛋白是BR信号转导途径的关键组分,目前对普通烟草中NtBRI1基因的研究较少,对BRI1的功能机制尚不明晰。因此,本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑普通烟草NtBRI1基因,对T0突变体的NtBRI1基因进行生物信息学分析,筛选关键结构域改变的突变体测定其NtBRI1基因表达量和观察其表型,以期初步解析普通烟草NtBRI1基因的生物学效应,为后续研究创制新的遗传材料。研究结果如下:（1）CRISPR/Cas9定点突变NtBRI1基因利用CRISPR/Cas9技术编辑NtBRI1基因,获得26株突变体,突变效率为25.7%（26/101）。靶位点1编辑效率为43.8%（91/208）;靶位点2编辑效率为71.2%（148/208）。突变以1-5bp的短片段的删除、插入或替换为主,也有2个克隆分别发生33bp和68bp的删除。在位点1碱基发生突变的情况主要以碱基替换为主（75/208）;在位点2碱基突变类型较多,以单碱基插入为主。（2）T0突变体NtBRI1基因的生物信息学分析筛选突变类型不同的T0突变体B-2、B-3、B-4、B-10、B-20、B-21、B-24做NtBRI1基因的生物信息学分析。结果表明,突变体NtBRI1基因功能结构域相同,在N端（52-87）都含有一个富含亮氨酸的重复序列,中间（194–207、243–301、312–372）含有亮氨酸重复序列。与野生型相比,中间的亮氨酸重复序列减少,无经典亚型亮氨酸重复序列,C端无蛋白激酶结构域。各突变体NtBRI1基因的蛋白二级结构以无规卷曲为主,还包括α螺旋和延伸链。各突变体NtBRI1基因蛋白三级结构相似,与野生型NtBRI1基因蛋白三级结构差异较大。T0突变体NtBRI1基因的编辑导致其关键结构域即蛋白激酶结构域（Protein kinase domain）缺失,从而使其三级结构与野生型差异明显。（3）T0突变体NtBRI1基因表达差异分析及其表型观察通过对T0突变体NtBRI1基因表达差异分析,发现突变体NtBRI1基因表达量均低于野生型,说明NtBRI1基因的编辑影响了NtBRI1基因的表达。NtBRI1基因表达量下降最明显的B-4、B-20和B-24,突变位点一致,表明相同突变位点的突变对NtBRI1基因表达的影响相似。观察T0突变体表型,发现突变体株高、节距均小于野生型,且突变体和野生型的差距随着植株生长在不断增大。不同突变体出现的性状存在差异,包括叶片数增多、现蕾期推迟、低叶位多分杈等。所获得的T0突变体表型各有差异,为后续研究创制了丰富的遗传材料。