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重金属铜是植物生命过程所必需的微量元素,但过多的铜也会对植物生长产生危害。本研究以小白菜品种上海青为试验材料,利用Cu2+含量10mg/L的营养液水培小白菜幼苗,通过cDNA-AFLP技术分析响应铜胁迫相关基因及其表达情况。试图从转录组水平对小白菜铜毒害进行研究,以期更好地揭示小白菜铜毒害的机理,为小白菜的遗传育种奠定基础。本研究主要结果如下:1.铜胁迫下小白菜叶片差异表达基因的cDNA-AFLP分析应用cDNA-AFLP技术,研究了铜胁迫下小白菜基因差异表达。选择了多态性较好的135对引物进行cDNA-AFLP扩增,获得了 180条差异表达转录衍生片段(TDFs),其中上调表达77条,下调表达61条,瞬时表达42条。选取其中152条差异表达TDFs进行回收测序,最终得到151个有效序列,Blastx比对结果显示,112条TDFs序列与已知基因具有较高的相似度,涉及能量代谢,物质合成与运输,逆境响应,信号转导等多种途径;另外有16条TDFs序列和功能未知或假定基因的同源性较高,其余23条TDFs序列与已知功能基因的同源性较低或零匹配,可能是未知的铜胁迫应答基因。从151条TDFs中选取4条铜胁迫相关基因克隆其全长,并进行荧光定量验证。2.RING锌指蛋白基因BcRING的克隆及其表达分析研究表明小白菜铜胁迫下锌指蛋白在调控植物防御和抗性方面发挥作用。本文应用cDNA-AFLP技术从小白菜中获得与铜胁迫相关的RING锌指蛋白TDF片段,命名为BcRING,进一步运用RACE技术克隆出具有完整阅读框的小白菜BcRING基因,该基因全长855bp,开放阅读框为606bp,编码202个氨基酸,分子量为21.32KD,理论等电点为6.87,为中性蛋白。结构分析表明该蛋白C-端含有一个保守的C3HC4型RING锌指结构域。进化树分析显示,BcRING蛋白与芜菁RING锌指蛋白的相似度高达98%,属于C3HC4型RING锌指亚家族。qRT-PCR结果表明在铜胁迫下该基因表现为下调表达,说明该基因可能参与对铜胁迫的应答反应,有助于进一步研究该基因在小白菜逆境应答中的作用及其作用机制。3.小白菜泛素结合酶E2基因BcUBCE2的克隆及其表达分析研究表明小白菜泛素结合酶E2基因BcUBCE2可能通过调控蛋白代谢参与铜胁迫响应。本研究用cDNA-AFLP技术获得与铜胁迫相关的泛素结合酶E2基因的TDF片段,命名为BcUBCE2,运用RACE技术克隆获得BcUBCE2基因cDNA全长,该基因的cDNA全长830bp,开放阅读框为459bp,编码152个氨基酸。结构分析发现该序列含有泛素结合酶E2活性位点和一个高度保守的半胱氨酸。进化树分析显示该基因所推导的氨基酸序列同拟南芥亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,在铜处理10d时BcUBCE2基因的表达量最高,推测其可能参与铜胁迫响应。4.小白菜AP2/ERF转录因子BcAP2ERF1的克隆研究表明小白菜BcAP2ERF1基因能够参与铜胁迫响应。本研究应用cDNA-AFLP技术获得与铜胁迫相关的AP2/ERF转录因子的TDF片段,命名为BcAP2ERF1,运用RACE技术获得小白菜BcAP2ERF1基因cDNA全长,该基因cDNA全长868bp,开放阅读框为606bp,编码202个氨基酸,分子量是22.88KD,理论等电点5.87,为酸性蛋白。结构分析表明,该蛋白C-末端富含作为转录激活区的酸性氨基酸,N-末端含有核定位区的碱性氨基酸,AP2/ERF结构域含有一个WLG和一个YRG功能单元。进化树分析结果显示,该基因所推导的氨基酸序列与甘蓝型油菜、羽衣甘蓝、水蒜芥的亲缘关系较近,高达98%、98%、99%,属于ERF类亚族。cDNA-AFLP差异表达分析显示在铜胁迫后小白菜BcAP2ERF1的表达量增加,说明其可能参与铜胁迫响应。5.小白菜氯离子通道蛋白基因BcClC-d的克隆及其表达分析研究表明小白菜氯离子通道蛋白基因在植物抗逆中具有重要作用。本研究应用cDNA-AFLP技术获得的与铜胁迫相关的氯离子通道蛋白基因的TDF片段,命名为BcClC-d,运用RACE技术克隆获得小白菜BcClC-d基因的cDNA全长,该基因cDNA全长2 752 bp,开放阅读框为2 376 bp,编码792个氨基酸,分子量为87.06 kD,理论等电点为8.35,为碱性蛋白。结构分析表明,该蛋白含有1个电压门控的氯离子通道和2个CBS结构域。进化树分析显示,该基因推导的氨基酸序列与拟南芥的相似度高达100%,属于C1C类氯离子通道蛋白。qRT-PCR结果表明在铜胁迫下该基因表达量增加,处理10 d时达到最高,推测其可能参与对铜胁迫的应答反应。