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本论文从流感预防与检测的具体现状出发,重点解决流感病毒的快速诊断与早期预防问题,从三个方面进行了研究.设计合成了A型流感病毒NP基因RT-PCR扩增引物,将扩增的NP基因与原核表达载体pGEX-4T-2进行连接,构建了原核融合表达载体.将所构建的融合表达载体用化学转化法转入大肠杆菌TG1进行原核融合表达.利用纯化的A型流感病毒NP蛋白免疫小鼠,成功构建了全套单链噬菌体抗体库,库容量达到8.7×10<7>cfu/mL,抗体库噬菌体包装滴度达到2.8 × 10<11>pFU.通过连续三轮固相"亲和-淘洗-富集",增加了特异性重组噬菌体抗体的比率,每轮筛选效率基本可以增加10倍.在1 500V~2500V范围内,随着电压的增加,电转后菌落生长个数从13个增加到1500个,转化效率增加了115.4倍.从96个噬菌体抗体库克隆中筛选到了10阳性克隆,其中3个克隆阳性结果较强,其OD450nm分别达到了0.469、0.582和0.507.阳性重组噬菌粒转染大肠杆菌HB21 51后,经过诱导培养在细菌培养液上清中分泌的A型流病毒单链噬菌体抗体浓度较底(OD<,450nm>达到0.22),而绝大部分的可溶性的单链感噬菌体抗体存在于细菌周质腔中.将扩增的NP基因与核酸疫苗表达载体进行了连接,构建了重组核酸疫苗.经IFA和ELISA鉴定,重组核酸疫苗在体外转染VERO细胞后24h开始进行表达.设计合成了A型流感病毒和B型流感病毒型通用性RT-PCR引物并进行RT-PCR反应,A型流感病毒和B型流感病毒都有很好的扩增,没有非特异性扩增.所建立的RT-PCR反应体系能够检测到1.6×10<-5>TCID<,50>浓度的流感病毒,比传统方法具有明显的敏感性(传统方法一般检出率要求在1.5×10<3>TCID<,50>,可以提高10<6>倍.所建立的多重RT-PCR反应体系能同时对A型流感病毒和B型流感病毒进行多重扩增,扩增产物分别为140bp和500bp左右.实验结果表明,将A型流感病毒NP基因进行原核融合表达,利用反复冻溶法提取表达产物并进行亲和纯化目的蛋白,得到了高纯度的NP蛋白,其中合理控制原核表达条件是获得NP蛋白可溶性表达的关键;利用噬菌体表面展示技术,成功表达了A型流感病毒NP蛋白的噬菌体单链抗体,能够特异性检测到A型流感病毒,而与B型流感病毒和腮腺炎病毒没有交叉反应,为进一步制备流感病毒免疫渗漏试剂盒奠定了基础;成功构建了A型流感病毒核酸疫苗,免疫小鼠后能够抵抗100TCID50流感病毒的攻击,表明该疫苗具有保护作用;成功设计了A型流感病毒和B型流感病毒引物,RT-PCR和多重RT-PCR结果表明,该引物能分别特异性扩增A型和B型流感病毒目的片段,没有非特异性扩增和交叉污染,能够在实际检测中应用.