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影响农作物生长和产量的最主要因素是环境胁迫,其中又以盐胁迫和干旱胁迫最为严重。解决这一问题最直接的途径是利用基因工程手段,培育耐盐作物品种。由于盐生植物可能具有进化上与非盐生植物截然不同的信号转导机构和调节控制机制,因此,分离识别盐生植物耐盐相关基因的研究不仅可以丰富我们对于植物耐盐机制的认识,而且可以为开发利用盐生植物耐盐基因资源,培育耐盐作物品种奠定基础,目前分离识别盐生植物耐盐相关基因已逐渐成为国际上植物耐盐领域的一个研究热点。
提取高质量的RNA是进行植物耐盐基因表达研究的前提。红树所含的大量次生物质给RNA提取造成了较大困难。经过摸索,本文发展了一项低成本,高效率且无需液氮的RNA提取方法。用该法制得的总RNA能够满足后续多种分子生物学实验的要求。在此基础上,本文首次构建了红树植物桐花树(Aegicerascorniculatum)3%海水胁迫下的正向抑制性扣除文库,一共获得602个质粒,整理测序结果共获得575条表达序列标签(ESTs)。并利用Microarray技术对该文库中566个克隆子进行了500mMNaCl胁迫2小时,5小时两个时间段基因表达谱的分析。共鉴定出68个至少在两个生物学重复中发生了差异表达的克隆子。其中63个为上调表达的克隆子,5个为下调表达的克隆子。这一结果与我们构建的是正向文库的实验设计相吻合。对该文库克隆子进行序列和表达模式分析表明:桐花树在受到盐胁迫时,既采取了一些与甜土植物相同的应答机制,又采取了一些特有的抗盐途径。为深入了解桐花树中盐诱导基因的功能,本文利用RACE技术克隆了5个桐花树盐诱导基因的全长cDNA序列,并选取了AcP5CS和AcCPI两个基因进行转基因拟南芥研究。转基因拟南芥研究结果表明:转AcP5CS和转AcCPI基因植株均获得了比对照组更高的抗盐能力。且在5种盐度下转AcCPI基因植株的生长状况均优于转AcP5CS基因植株和对照组。
为了解桐花树抗盐基因AcP5CS是否存在适应性进化,本文扩增了桐花树以及紫金牛科其他属共20个物种的P5CS基因的部分CDS序列,两两计算了Ks-Ka的值。结果表明:所检测的20个物种的P5CS在其所研究的序列内均未发生适应性进化。这项结果与自然界只在极少数基因发现了适应性进化的事实相一致。本论文的研究工作改进了现有RNA提取技术,对红树植物盐诱导SSH文库的构建和芯片点制、杂交,克隆全长cDNA,功能鉴定等实验功能基因组学的研究取得了初步结果,发现一批新的抗逆基因,为进一步研究其基因结构和时空表达谱及其生物学功能奠定了基础,即为实验室建立了红树植物功能基因筛选及表达谱分析的研究平台。