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背景：心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)主要表现为心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)数目的增多和心肌细胞外间质胶原的过度沉积,可存在于多种心血管系统疾病。心肌纤维化造成心肌僵硬度增加,使心室的收缩和舒张功能下降,并影响心肌电生理,可导致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等并发症,严重危害人类身体健康。心肌纤维化是高血压性心脏病的主要病理基础之一。近年来,随着高血压病发病率的增高,高血压性心肌纤维化的发生机制和预防成为国内外研究的热点。高血压心肌纤维化的病理生理过程是非常复杂的。近年来研究发现,炎症反应在其病理过程中发挥了重要的作用,MF被认为是高血压、激素异常分泌和炎症反应之间反复相互作用的结果,是一个慢性炎症反应过程。肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族的新成员,可在多种组织细胞中表达。TWEAK除具备TNF超家族的共同结构特征和对肿瘤细胞有杀伤作用外,还有调节细胞的生长、增殖及凋亡,促炎性反应及血管生成等作用。TWEAK能够通过刺激细胞分泌多种炎性因子,促进心肌成纤维细胞的增殖和胶原表达增多,从而促进心肌纤维化的发生和发展,但其机制尚不明确。研究发现,核转录因子NF-κB是介导血管紧张素II (angiotensin II, Ang II)、 TNF-a促心肌成纤维细胞增殖和胶原表达作用的关键因子。基质金属蛋白酶9(matrixmetallopeptidase9, MMP9)被证实在细胞外基质重塑及心肌纤维化过程中起主要作用。但TWEAK与NF-κB, MMP9在心肌纤维化中的关系尚未见报道。目的：研究肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(TWEAK)对大鼠心肌成纤维细胞NF-κB通路的影响及作用机制,探讨NF-κB、 MMP9等因子与心肌纤维化的关系。方法：1.采用胰酶消化法培养新生Wistar大鼠心肌成纤维细胞,倒置显微镜观察大鼠心肌成纤维细胞的形态,波形蛋白免疫荧光法鉴定心肌成纤维细胞。实验选用第2-4代细胞。2.采用qRT-PCR法检测两组NF-κB和MMP9基因表达实验共分两组,对照组：不加干预因素；TWEAK组：加入rhTWEAK,使其浓度达100μg/L。继续培养6h后分别提取RNA检测NF-κB的表达情况,24h后分别提取RNA检测MMP9的表达情况。3.采用Western blot法检测NF-κB和MMP9蛋白表达TWEAK干预后检测NF-κB的蛋白表达：①浓度梯度组：按rhTWEAK的终浓度分为对照组(0μg/L)、1μg/L组、10μg/L组、100μg/L组和200μg/L组,继续孵育8h后提取核蛋白；②时间梯度组：培养液换为含100μg/L rhTWEAK的无血清DMEM继续孵育,按分组不同分别孵育0、3、6、9、12h后提取核蛋白。TWEAK和PDTC干预后检测NF-κB蛋白的表达：①TWEAK组：培养液换为含100μg/L rhTWEAK的无血清DMEM,继续孵育6h后提取核蛋白；②TWEAK+PDTC组：培养液换为含100μg/L rhTWEAK和100μmol/L PDTC的无血清DMEM,继续孵育6h后提取核蛋白。TWEAK和PDTC干预后检测MMP9的蛋白表达：TWEAK+PDTC组：培养液换为含100μg/L rhTWEAK和100μmol/L PDTC的无血清DMEM,继续孵育24h后提取蛋白；②刺激组：换含100μg/L rhTWEAK的无血清DMEM,继续孵育24h后提取蛋白；③对照组：只加无血清DMEM,继续孵育24h后提取蛋白。4.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定TWEAK和PDTC干预后细胞增殖情况培养CFs至指数生长期,调整细胞密度为5×103个/孔接种于96孔培养板中,培养24h后,换DMEM培养液继续培养,24h后分组：①TWEAK+PDTC组：换含100ug/L rhTWEAK和100umol/L PDTC的DMEM;②TWEAK组：换含100ug/LrhTWEAK的DMEM;③对照组：只加DMEM.继续培养48h后,MTT法测定各组细胞增殖情况。结果：1.qRT-PCR检测NF-κB和MMP9的表达,刺激组NF-κB(5.3517)和MMP9(5.8971) mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)。2.不同浓度的rhTWEAK刺激8h后,NF-κB蛋白表达呈现剂量依赖性增加。对照组(0.510±0.011)、1μg/L组(0.860±0.069)、10μg/L组(1.224±0.010)、100μg/L组(1.908±0.055)表达依次增加(n=3)(P<0.01)。而200μg/L rhTWEAK组(1.942±0.069)与100μg/L组相比未见显著性变化(P>0.05)。3.100μg/L rhTWEAK刺激3h后NF-κB蛋白表达(0.815±0.063)开始增加,6h后(1.426±0.056)达到最大值,12h后(0.456±0.048)明显衰减(n=3)(P<0.01)。4.100ug/L rhTWEAK作用24h后,与对照组(0.232±0.010)相比,刺激组(0.871±0.018)MMP9表达明显增加；用100umol/L PDTC抑制NF-κB表达后,TWEAK+PDTC组(0.422±0.022)MMP9表达较刺激组显著减少(n=3)(P<0.01)。5.100ug/L rhTWEAK作用后刺激组A492值显著高于对照组(P<0.01),用100umol/LPDTC抑制NF-κB后,TWEAK+PDTC组A492值明显降低(P<0.05)。结论：1. rhTWEAK可促进大鼠成纤维细胞的NF-κB和MMP9mRNA表达上调,蛋白表达明显增加,同时促进心肌成纤维细胞增殖。NF-κB蛋白表达对rhTWEAK的刺激呈剂量依赖性关系,浓度为100μg/L时达到最大值；rhTWEAK刺激后6h后,NF-κB蛋白表达达到最大值,12h后明显衰减,rhTWEAK呈作用时间依赖性关系。2. NF-κB抑制剂PDTC可明显减弱由TWEAK介导的MMP9蛋白表达和细胞增殖效应,表明TWEAK促进心肌纤维化的作用依赖于NF-κB通道的激活。