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第一部分靶向骨桥蛋白基因的shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定[摘要]目的构建针对骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)基因的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)序列,合成pSicoR-GFP-shRNA慢病毒重组体,筛选对OPN基因表达抑制效率最佳的shRNA序列。方法参照OPN GeneBank上的序列设计合成shRNA-A,及不针对C57小鼠任何基因的阴性对照序列shRNA-NC,参考相关文献合成针对骨桥蛋白基因的shRNA-B。将合成的shRNA插入到线性化的pSicoR-GFP慢病毒载体中；然后转染E.coli JM109感受态细胞,对长出的菌落进行PCR鉴定,PCR鉴定阳性的克隆再进行测序。鉴定序列无误后,将之与pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91辅助质粒包装,然后共转染293FT细胞,进行慢病毒的包装及滴度测定,控制滴度在1×109TU/ml以上。用构建好的慢病毒感染小鼠肝细胞,检测不同shRNA序列对OPN基因表达的抑制效果,筛选最佳shRNA序列。结果经RT-PCR和Western-Blot检测发现：靶向OPN基因的shRNA慢病毒表达载体转染小鼠肝细胞后,序列shRNA-A/B均可有效抑制小鼠肝细胞OPN基因的表达,其中shRNA-A序列效果最佳(可达80%-90%)。结论成功构建靶向OPN基因的shRNA慢病毒表达载体,其转染小鼠肝细胞后可显著抑制OPN基因的表达,这为进一步体内抑制试验奠定了基础。第二部分C57小鼠肝脏骨桥蛋白基因沉默动物模型的建立[摘要]目的将包装好的慢病毒经尾静脉注射到C57小鼠体内,抑制其肝脏骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)基因的表达,建立OPN基因沉默小鼠动物模型。方法取30只C57小鼠随机平均分为：空白对照组(Blank control,BC):经尾静脉注射灭菌PBS液200u1；阴性对照组(Negative control,NC):经尾静脉注射200ul pSicoR-GFP-shRNA-EC慢病毒液；实验组(Experimental group,EG):通过尾静脉注射200ul pSicoR-GFP-shRNA-A的慢病毒液。注射后第72h、96h、7d、14d,各组随机取2只小鼠断颈处死。收集肝脏,一部分立即用OCT包埋剂进行包埋,冰冻切片检测肝脏慢病毒转染效果：另一部分行qRT-PCR及Western-Blot检测OPN基因表达水平。结果与空白对照组、阴性对照组相比,实验组OPN基因mRNA及蛋白表达水平明显下降,抑制效率在70%-80%之间；空白对照组与阴性对照组之间无明显差别。结论利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,可以成功制备小鼠肝脏OPN基因沉默动物模型。第三部分骨桥蛋白基因沉默C57小鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的检测[摘要]目的研究骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)基因表达被抑制后,C57小鼠肝脏胆固醇代谢及转运相关基因表达的变化,为进一步研究OPN在胆固醇结石发生过程中与肝脏胆固醇代谢相关基因的关系提供技术支持。方法通过RT-PCR及Western-Blot检测肝脏胆固醇代谢及转运相关基因HMG-CoA还原酶、CYP-7α1、ABCG5/8的mRNA及蛋白表达的变化。结果RT-PCR结果显示：OPN表达受抑制后,肝脏胆固醇代谢相关基因HMG-CoA还原酶、CYP-7α1、ABCG5/8的mRNA含量无明显变化,Western-Blot结果与之相符。结论通过该部分实验,我们熟练掌握RT-PCR、Western-Blot法检测HMG-CoA还原酶、CYP-7α1、 ABCG5/8mRNA及蛋白表达的变化。抑制C57小鼠肝脏OPN基因表达后,HMG-CoA还原酶、CYP-7α1、ABCG5/8的表达未产生明显变化。通过进一步查阅文献,我们认为产生这一现象的原因可能是：1.OPN是在致病因素导致机体代谢紊乱状态的前提下高表达,然后对相关基因的转录和翻译发挥调节作用的；2.OPN表达水平变化对相关基因表达的影响可能需要较长的时间(约2月)才能表现出来。总结,本课题利用慢病毒介导的RNA干扰技术,成功制备出C57小鼠肝脏OPN低表达模型,为进一步研究OPN在胆固醇结石形成过程中对胆固醇代谢的调节作用及机制提供了有力的研究工具。通过第三部分的研究,不仅为后续实验奠定了方法学基础,而且提示我们：进一步的研究须对OPN低表达C57小鼠饲以高脂、高胆固醇饮食,构建胆固醇结石模型进行进一步探讨。