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目的旨在探索miR-144-3p靶向调控ATG4a抑制自噬体形成及自噬溶酶体成熟进而影响BCG在巨噬细胞内存活,阐明miR-144-3p在结核分枝杆菌感染宿主细胞中的调控机制。方法(1)利用Real-time PCR检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞不同时间miR-144-3p的表达水平,然后经生物信息学软件预测分析其潜在靶向调控作用的基因。(2)构建p MIR-Report-ATG4a/mut-3’UTR的重组质粒,利用双荧光素酶报告系统、Real-Time PCR和Western blot分别检测荧光素酶的活性、ATG4a的m RNA和蛋白表达水平,验证miR-144-3p与ATG4a的靶向调控关系。(3)利用激光共聚焦显微镜、透射电镜、Real-Time PCR和Western blot方法分别检测LC3II的分布、自噬小体及自噬溶酶体的超微结构及ATG4a、P62和LC3II/I自噬相关蛋白的表达情况,研究miR-144-3p对细胞自噬体形成及自噬溶酶体成熟的影响。(4)分别将miR-144-3p mimic、inhibitor转染到RAW264.7巨噬细胞中,或用雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤(3-MA)刺激RAW264.7巨噬细胞,在此基础上用BCG(MOI=10)感染细胞24 h后,利用Real-Time PCR方法检测各组细胞中BCG的存活量,以此研究miR-144-3p对BCG存活的影响。结果(1)BCG感染RAW264.7细胞12 h,24 h后,miR-144-3p的表达水平较正常对照组升高(p<0.01),但随着感染时间的延长至48 h后,miR-144-3p的表达水平较24 h有所下降,但仍显著高于未感染组(p<0.05)。(2)双荧光素酶结果分析可知,转染miR-144 minic组与突变体的荧光素酶活性相比下降5.5倍,与正常对照组相比下降6.1倍(p<0.05);相反,转染miR-144-3p inhibitor组,ATG4a的荧光素酶活性与正常对照组的活性相比升高6.6倍(p<0.05);检测靶基因ATG4a m RNA及蛋白表达水平发现,转染miR-144 minic组可明显抑制ATG4a的m RNA及蛋白表达水平。(3)转染miR-144 mimic后,可显著抑制LC3II的形成、溶酶体及自噬溶酶体的成熟;相反,转染miR-144 inhibitor后,LC3II在细胞内呈点状聚集在细胞膜周围,自噬体和自噬溶酶体数量增多;此外,miR-144过表达后可明显抑制自噬相关蛋白ATG4a及LC3II/I的水平,P62累积量高于正常组;但抑制miR-144的表达后,LC3II的表达量高于对照组,且较单纯BCG作用巨噬细胞24h后LC3II的表达水平高(P<0.05),P62蛋白含量低于正常细胞组。(4)荧光定量PCR检测RAW264.7细胞内BCG的含量,结果表明,转染miR-144-3p质粒后BCG的存活量高于正常组(p<0.01);相反,抑制了miR-144-3p的表达后,BCG的存活量明显低于正常组。结论通过本实验研究证明结核分枝杆菌及BCG感染的RAW264.7细胞中miR-144-3p表达上调,过表达的miR-144-3p可靶向抑制自噬相关基因ATG4a的表达,抑制自噬小体和自噬溶酶体的成熟,从而有利于结核分枝杆菌在巨噬细胞内存活。