新型信号放大技术的建立及其应用研究

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随着生物学研究领域的不断扩展,常常遇到一些不能直接扩增的待测分子,但又由于其浓度较低而无法检测,传统的分析方法无法检测含量太低的待测物质,发展高灵敏度的信号放大技术已成为当前生化分析的重点研究方向。在生化分析中,目前常见的信号放大技术主要有金纳米信号放大,工具酶信号放大,生物条码信号放大技术等,已经广泛应用于核酸,蛋白质,小分子等物质的检测。本论文主要内容是将电化学分析技术,化学发光分析技术,核酸适配体识别技术,信号放大技术相结合,研制高灵敏度,高选择性的新型化学与生物传感器,对特定物质进行选择性的识别和测定,从而建立有效的化学与生物传感器。全文具体包括以下六章:第一章绪论。绪论部分概述了信号放大技术和常见的检测方法。主要介绍了几种主要的信号放大技术及其在分析检测中的应用和发展趋势,电化学,化学发光分析方法基本概念、原理及应用现状。第二章基于碳纳米粒子吸附和金纳米粒子信号放大技术电化学测定多巴胺的研究。首先用金纳米粒子(AuNPs)吸附电化学信号标记物硫堇(Th),进一步通过Au-S键将活化了巯基的多巴胺(DA)适体互补链DNA固定在AuNPs表面制得电化学探针;在体系中加入适体链,适体与其互补链配对形成部分互补的双链。加入待测物DA后,适体优先于DA结合,从双链释放出来,又形成了电化学探针。利用碳纳米粒子修饰金电极与释放出来探针的吸附作用,制得了电化学传感器。适体的识别能力使该传感器对DA有很高的选择性,纳米粒子电化学探针提高了测定的灵敏度。在3.0×10-8~3.0×10-6M范围内,多巴胺的浓度与峰电流强度呈良好的线性关系,检出限为1.0×10-8M(3σ)。第三章基于熵驱动分子开关和信号放大技术电化学测定DNA。本章中,首先用AuNPs修饰金电极,将发卡DNA通过Au-S键固定在电极表面,目标DNA与发卡结构部分互补,在熵驱动下打开发卡结构。与发卡DNA有更多互补碱基的DNA链能够将目标DNA竞争杂交,而释放目标DNA,从而进一步打开另外一个发卡DNA,这样在熵驱动下不断打开发卡结构。当由纳米粒子负载信号分子的电化学探针加入体系中,经过互补配对连接到电极上已经打开的打开发卡结构上,实现电化学测定目标DNA。由于释放的目标DNA不断打开电极上的发卡结构,可以实现信号放大;目标链的检测可以通过测定电化学探针的量实现。该传感器在3.0×10-14~2.0×10-12M范围内对目标DNA呈现良好的线性,检出限为1.0×10-14M(3σ)。第四章基于切口酶酶切信号放大技术的食品中毒素——赭曲霉毒素A高灵敏度检测方法的研究利用。设计的适体互补序列DNA对磁性微珠进行修饰;根据生成连接DNA系列设计捕获DNA序列,利用其对羧基化的磁性微珠进行修饰,分别得到功能化的磁性微珠FMB1和FMB2。利用功能化的磁性微珠FMB1和FMB2,结合DNA聚合酶聚合作用和Nb.BbvCI切口酶酶切作用耦合的循环技术,以化学发光纳米粒子为探针构建高灵敏度化学发光分析检测方法,并以赭曲霉毒素A为分析测定对象建立食品中毒素检验的高灵敏度分析方法。该方法对赭曲霉素A有良好的选择性和灵敏度,检测的线性范围为1.0×10-12到1.0×10-10g mL-1,检测限为3.0×10-13g mL-1。第五章纳米粒子修饰电极及其在孔雀石绿检测中的应用研究。本章中采用电化学方法测定孔雀石绿(MG)。MG直接在电极表面发生氧化还原反应产生电信号,无需信号转换方法。因此,检测快速,仪器简单。又由于实验中采用AuNPs修饰电极,由于纳米粒子的特殊性能,大大提高了电极表面的电子传递效率,提高了传感器的灵敏度。该方法对MG检测的线性范围是2.7×10-8mol L-1到2.7×10-5mol L-1,检出限为3.0×10-9mol L-1。第六章电沉积胶体金修饰电极及其在醌氢醌检测中的应用研究。首先采用直接电沉积法修饰电极,再通过电化学方法检测醌氢醌(HQ)。直接在电极上进行电沉积法还原省去了制备金属纳米粒子的繁琐操作步骤。而且电沉积法具有可控性好,反应条件较为温和,制备时间短,且成本相对而言较为低廉的优点。电沉积法修饰的电极,表面均匀且修饰上的AuNPs密度较高。因此,具有很好的灵敏度和选择性。该方法对MG检测的线性范围是5.0×10-7mol L-1到2.0×10-4mol L-1,检出限为3.0×10-7mol L-1。
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