背景:机械通气(Mechanical Ventilation,MV)作为临床上一种重要的生命支持手段,同时为抢救患者和病因治疗赢取时间。然而,长时间机械通气(Prolonged Mechanical Ventilation,PMV)则可以导致以膈肌肌力迅速下降和肌肉明显萎缩为特征的膈肌功能障碍,被命名为呼吸机相关性膈肌功能障碍(Ventilator-Induced Diaphragm Dysfunction,VIDD)。VIDD与撤机困难、机械通气时间和住院时间延长、并发症和死亡率增加相关。膈肌线粒体氧化应激致蛋白水解酶系统活化是VIDD的重要机制之一,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)被证实介导了自噬的活化,而自噬被认为具有“双刃剑”的作用。因此,本研究旨在探讨自噬在长时间机械通气膈肌功能障碍中的作用,以及ROS与自噬之间的相互作用关系对蛋白水解酶系统的调节作用。目的:(1)探讨长时间机械通气是否增加膈肌自噬水平以及自噬在VIDD发生中的可能作用;(2)阐述长时间机械通气中大鼠膈肌自噬活化与线粒体超氧化物生成的关系及二者在VIDD中的相互作用对蛋白水解酶系统的影响。方法:(1)长时间机械通气诱导膈肌自噬及VIDD:成年雄性Wistar大鼠随机分配为4组:(1)短时间自主呼吸组(SSB,假手术后自主呼吸4 h,n=5);(2)短时间机械通气组(SMV,机械通气4h,n=5);(3)长时间自主呼吸组(PSB,假手术后自主呼吸12 h,n=5);(4)长时间机械通气组(PMV,机械通气12h,n=5)。全程监测心率、血压、肛温,短时程组和长时程组行动脉血气和血常规分析的频率分别是2 h/次和4 h/次;实验后离体检测膈肌肌条的电刺激机械收缩性能;透射电镜观察自噬溶酶体相关结构;HE及免疫荧光染色,观测肌丝横截面积(Cross sectional area,CSA);实时荧光定量PCR检测自噬相关基因的相对表达水平;Western-blot检测膈肌自噬相关蛋白LC3B-II/I比值、Caspase-3和钙蛋白酶活性、以及蛋白泛素E3连接酶Atrogin-1和MuRF1蛋白表达水平;免疫化学法检测膈肌ROS产物。(2)膈肌自噬活化与线粒体ROS生成的关系及二者在VIDD发生中的作用:成年雄性Wistar大鼠随机分配为3组(n=10/组):(1)长时间自主呼吸对照组(CON,假手术后自主呼吸12 h,n=5);(2)长时间(12 h)机械通气组(CMV,n=5);(3)长时间(12 h)机械通气加线粒体氧自由基清除剂Mito-Tempol组(CMV+Mito-T,n=5);每组另外5只,给予自噬工具药Colchicine后再干预。全程监测心率、血压、肛温,每4 h行动脉血气分析和血常规分析;实验后离体检测膈肌肌条的电刺激机械收缩性能;透射电镜观察自噬溶酶体相关结构;HE及免疫荧光染色,观测肌丝横截面积(Cross Sectional Area,CSA);ELISA检测膈肌炎症因子表达水平;实时荧光定量PCR检测自噬相关基因的相对表达水平;Western-blot检测膈肌自噬相关蛋白LC3B-II/I比值、Caspase-3和钙蛋白酶活性、以及蛋白泛素E3连接酶Atrogin-1和MuRF1蛋白表达水平;免疫化学法检测膈肌ROS产物。结果:(1)长时间机械通气诱导膈肌自噬活化:实验前后动物的体重及各项生命体征指标(心率、血压、肛温)无显著改变。离体膈肌肌力检测显示PMV组离体膈肌最大等张收缩力、最大强直收缩力、电刺激-力效应曲线和抗疲劳能力均较SSB、SMV和PSB组显著下降;电镜显示PMV组膈肌自噬小体相关结构数目较SSB、SMV和PSB组显著增多、并且出现脂滴集聚、肌丝结构排列紊乱现象;免疫荧光染色显示PMV组快肌纤维和慢肌纤维的肌丝横截面积显著小于SSB、SMV和PSB组;Western-blot结果显示PMV组膈肌LC3B-II表达、LC3B-II/LC3B-I比值、Caspase-3和钙蛋白酶活性以及E3连接酶Atrogin-1和MuRF1蛋白表达水平显著高于SSB、SMV和PSB组;生化结果显示PMV组膈肌ROS产物较SSB、SMV和PSB组显著增多,差异均具有统计学意义;而上述指标在SSB、SMV和PSB组之间均无显著差异。上述结果提示长时间机械通气导致膈肌收缩力下降,伴随蛋白水解酶系统的活化和膈肌自噬活化,提示蛋白水解酶系统和自噬在VIDD发展中发挥着重要作用。(2)膈肌自噬活化与线粒体ROS生成的关系及二者在VIDD发生中的作用:动物实验显示,动物的一般情况(体重、肛温、心率、血压、血气、血常规)在实验组之间没有明显差异,炎症因子TNF-α在CMV组较其他三组显著增加。首先,工具药Colchicine和Mito-Tempol二者均可显著增加膈肌收缩力和膈肌抗疲劳能力、改善膈肌萎缩、减少自噬溶酶体相关结构的数目。利用Colchicine特异性抑制自噬小体降解可有效降低PMV导致的膈肌线粒体ROS产物的生成,说明机械通气中膈肌线粒体ROS形成至少部分依赖于自噬体的活化。此外,利用线粒体靶向超氧化物清除剂Mito-Tempol可明显降低线粒体ROS产物的生成,并减少自噬小体的数目。与此同时,PMV+Mito-T组钙蛋白酶和Caspase-3蛋白活性均明显低于PMV组,而在PMV+COL组钙蛋白酶和Caspase-3蛋白活性均明显高于PMV组和PMV+Mito-T组,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。此外,PMV+COL组自噬相关蛋白LC3B-II和LC3B-II/I比值较PMV组显著增加,而在PMV+Mito-T组自噬相关蛋白LC3B-II和LC3B-II/I比值较PMV组显著降低且与CON组无显著差异;长时间CMV显著增加膈肌组织中Atrogin-1和MuRF1的蛋白表达水平,而在PMV+COL和PMV+Mito-T组泛素连接酶Atrogin-1和MuRF1蛋白表达较PMV组均明显降低。形态学分析显示PMV+COL组和PMV+Mito-T组CSA明显高于PMV组,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。上述结果表明,自噬小体活化和线粒体ROS产物生成之间存在正向调控,是PMV导致膈肌萎缩和收缩力下降的重要机制;抑制自噬小体降解后,膈肌代偿性增加钙蛋白酶和Caspase-3蛋白酶活性,以降解氧化损伤的胞质蛋白和细胞器。结论:(1)长时间机械通气可诱导健康大鼠呼吸机相关性膈肌功能障碍,表现为膈肌最大等张收缩力、最大强直收缩力、抗疲劳能力和力-频率效应曲线的下降;形态上显示膈肌快、慢肌纤维横截面积减少;分子水平显示四种蛋白水解酶系统(钙蛋白酶、Caspase-3、泛素蛋白酶和自噬)的激活。蛋白水解酶系统是VIDD的主要机制,蛋白水解酶系统的激活可能与膈肌氧化应激有重要关系。(2)长时间的CMV对自噬流的影响是:增加自噬小体的合成,同时抑制自噬小体的降解;CMV诱导的自噬活化与膈肌ROS产物之间形成正反馈作用,共同介导VIDD的进展;当自噬小体降解受到抑制时,钙蛋白酶和Caspase-3以代偿性增加方式降解集聚的胞质蛋白质和功能受损的细胞器;线粒体靶向自由基清除剂可以缓解VIDD发展进程。表明自噬在VIDD发展过程中起重要作用,提示抑制自噬和使用线粒体靶向抗氧化剂可以缓解VIDD的发展进程。