蛋白质翻译后修饰是翻译后调控蛋白质功能的重要方式。蛋白质翻译后修饰的富集和鉴定是研究蛋白质翻译后修饰功能的前提条件。化学生物学方法具有可靠的富集能力,质谱技术具有高灵敏度的鉴定能力。蛋白质翻译后修饰是蛋白质研究的前沿问题,然而目前的研究中缺少有效的方法整合这两种方法的优点。因此,本课题拟将两种技术有机结合,提高对翻译后修饰的鉴定与功能研究能力。通过高分辨质谱的鉴定和Gal-T1化学酶法的标记,发现YTHDF1与YTHDF3具有高丰度的O-Glc NAc修饰而同源的YTHDF2不具有修饰。其中,S157与S196是YTHDF1的修饰位点,而T205与S229是YTHDF3的修饰位点。YTHDF1/3的O-Glc NAc修饰发生在蛋白的N端功能区域,抑制YTHDF1/3与翻译相关蛋白质的相互作用,进而下调YTHDF1/3对底物m RNA的翻译促进作用。另外,在不同的细胞系中使用Gal-T1化学酶法进行标记,发现YTHDF1/3在HEK293T细胞中具有高水平的O-Glc NAc修饰（～50%）,而在He La细胞中则具有低水平的修饰（～15%与～25%）。同时,O-Glc NAc修饰水平也会随着细胞周期的不同阶段而被动态调控。使用Ac4Glc NAz小分子作为化学生物学代谢标记物,发现小鼠卵细胞GV期至MII期的发育过程中具有O-Glc NAc修饰。通过Gal-T1化学酶法的化学生物学富集与高分辨质谱的鉴定,在微量样品的水平上,发现CNOT2是小鼠卵细胞发育过程中主要的O-Glc NAc修饰底物,有高达50%左右的修饰水平。CNOT2T114位点的修饰能够影响CNOT2的空间结构,促进其与CNOT1的相互作用。CNOT2与CNOT1的结合会直接促进CCR4-NOT复合体的组装,使得复合体具有正常的去poly A尾的核酸酶活性。当CNOT2失去该T114位点的O-Glc NAc修饰时,会导致小鼠卵细胞与胚胎发育的失常甚至胚胎致死。通过遗传密码扩展与SORT的化学生物学技术,将Met K（甲硫氨酰化赖氨酸）与Pra K（氨基酰化赖氨酸的类似物）这2种非天然氨基酸引入蛋白质组并使用高分辨质谱进行鉴定,发现泛素化修饰能够发生于氨基酰化引入的α-氨基上,形成氨基酰化赖氨酸的泛素化修饰（K-XUb）。使用Ubi Site抗体富集的泛素化组数据集进行搜索,鉴定到2205个K-XUb修饰位点与1217个修饰底物。这些修饰底物涉及细胞周期、蛋白质加工过程等重要的细胞功能通路。K-XUb修饰能够促进底物蛋白发生蛋白酶体依赖性的降解,且这种降解效果能够被蛋白酶体抑制剂抑制。本课题采用化学生物学技术与质谱技术的联用,实现了翻译后修饰新位点与新类型的鉴定。使用该联用方法,能够充分发挥了化学生物学技术对翻译后修饰的富集能力的优势与质谱技术高灵敏度的鉴定能力,对蛋白质的翻译后修饰研究有着重要的作用。