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目的:1通过研究真菌漆酶复合物中酶与配体的相互作用,进一步揭示其催化氧化机制。2基于降解实验数据探索真菌漆酶降解有机磷毒物的规律和机制。3改造漆酶并预测改性漆酶降解有机磷毒物的效果,通过实验制备理论预测效果好的改性漆酶。方法:1从五个已知的真菌漆酶复合物的晶体结构出发,利用分子模拟技术和能量优化方法,研究其在晶体结构和非晶体状态下酶与配体的相互作用,在分子水平进一步揭示其催化氧化机制。2基于文献报道的降解实验研究总结反应规律,并利用分子模拟技术和分子对接方法探索真菌漆酶降解有机磷毒物的机制。3在漆酶作用机制研究的基础上,提出漆酶的分子改造策略,利用同源建模方法构建不同点突变漆酶的空间结构模型。4利用分子模拟技术和分子对接方法,理论预测改性漆酶降解有机磷毒物的效果。5利用酵母表达系统制备理论预测效果好的改性漆酶。结果:1在1KYA中与底物发生疏水作用的氨基酸残基主要有Phe162、Leu164、Phe265、Pro391和Gly392,在2HRG中的主要有Val162、Phe331、Pro390和Gly391,在3FU7、3FU8和3FU9中的主要有Ala191、Pro192、Phe371、Phe427、Leu429。此外,底物结合到漆酶活性口袋后,其结构中富含电子的基团贴近其中保守的组氨酸,并且几乎总是与之形成氢键。2真菌漆酶与介质组成的漆酶介质体系可以有效降解一类具有V类神经毒剂结构特征的有机磷毒物,其中漆酶总是白腐菌漆酶,而介质是影响催化效率的重要因素。有机磷毒物中处在连接硫原子的β位碳原子上的氮原子具有十分重要的地位,它很可能在反应中首先失去电子。在中性溶剂中,它可能被氧化生成N-氧化物,这在水溶液中是稳定的,但当存在有机溶剂时则会发生竞争性的分解反应。3本研究利用MOE-Dock模块提供的分子对接功能探索真菌漆酶与底物对接的优化条件发现:将分别在Amber99力场和MMFF94x力场中进行加氢处理的酶和底物继续在MMFF94x力场中进行对接、放置函数选用Triangle Matcher、打分函数选用London d G、优化函数选用Forcefield、结果评估依据结合自由能,可以较好展现真菌漆酶与底物的相互作用。4真菌漆酶催化氧化一类具有V类神经毒剂结构特征的有机磷毒物时,底物与酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多个氨基酸残基发生疏水作用,底物的氮端贴近其中保守的组氨酸,底物的磷端处于活性口袋外侧,并与Gly392形成氢键。5为了提升漆酶直接催化降解较难处理的有毒有害物的能力,本研究通过分析认为改造漆酶活性口袋中的氨基酸、增强两者间的结合亲和力是有效的改造策略。变色栓菌漆酶的来源和应用十分广泛,而且其降解有机磷毒物的实验也取得了很好的效果,是很有潜力的改造对象。6本研究利用MOE-Homology Model模块提供的同源建模功能构建1KYA突变结构的模型,建模试验结果表明:设置模型打分函数为GB/VI、力场函数为Amber99,在建模完成后优化处在高能角的氨基酸,可以构建较为可靠的突变漆酶结构模型。7本研究分别构建了变色栓菌漆酶的F162A突变、D206A突变、F265A突变、F332A突变、P391A突变、P391L突变和F162A/F332A突变的结构模型。分析所建模型的拉氏图发现,高能角占该酶氨基酸总数的比例不超过0.6%,而且均处在酶活性部位外。除D206A突变和P391L突变外,突变漆酶的活性口袋均变大了,其中F265A突变、F332A突变和F162A/F332A突变显著扩大了底物入口。8变色栓菌漆酶在发生F265A突变、F332A突变、P391A突变和P391L后与VX的结合自由能降低了,而在发生F162A突变、D206A突变和F162A/F332A突变后该参数升高了,其中变化最大的是P391A突变(大约降低了10%)。9改性漆酶与VX的结合模式和未突变时相比并未发生显著改变,底物与酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多个氨基酸残基发生疏水作用,底物的氮端贴近其中保守的组氨酸,底物的磷端处于活性口袋外侧,可能与Gly392形成氢键。10变色栓菌漆酶在发生F162A突变、F332A突变、P391A突变和F162A/F332A突变后,活性口袋中组氨酸的NE2原子与VX中氮原子之间的距离大大减少了,从6.67?分别降至4.63?、4.56?和4.45?和4.51?。11利用毕赤酵母GS115表达系统制备了含P391A突变变色栓菌漆酶的溶液4 ml,实验其浓度为0.24 mg/ml。结论:1疏水作用是影响漆酶底物和氧化产物交替与酶结合或释放的重要影响因素。当底物结合到漆酶活性口袋后,其结构中富含电子的基团几乎总是与活性口袋中保守的组氨酸形成氢键,这可能会提高电子从底物传递到漆酶T1Cu的效率,进而提高漆酶的催化效率。2真菌漆酶与一类具有V类神经毒剂结构特征的有机磷毒物发生相互作用时,底物与酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多个氨基酸残基发生疏水作用,这是两者间的主要结合力;底物的氮端嵌入到活性口袋中,贴近其中的组氨酸,这可能会提高电子传递的效率;底物的磷端处于活性口袋外侧,与Gly392形成氢键。3本研究分别构建了变色栓菌漆酶的F162A突变、D206A突变、F265A突变、F332A突变、P391A突变、P391L突变和F162A/F332A突变的结构模型。基于改性漆酶与VX的相互作用我们认为,F162A突变、F332A突变、P391A突变和F162A/F332A突变是该酶很有希望的改造方向。本研究通过实验制备了理论预测活性可能最高的P391A突变漆酶,其活性有待进一步验证。