卵巢内直接注射外源质粒DNA，可以高效获得转基因小鼠等动物。但有关质粒DNA是如何进入卵巢中的卵母细胞并整合到其染色体中的，这一过程目前尚无直接的实验证据。本文针对上述问题进行了详细研究。 在卵巢内直接注射质粒pIRES-EGFP 24hr后，取出实验组小鼠的卵巢，经多聚甲醛固定后进行常规石蜡切片。将EGFP基因中454 bp片段用地高辛进行标记，作为探针，对卵巢的石蜡切片进行原位杂交。结果显示，注射质粒24 hr后，卵巢切片中的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡中都可见阳性信号，表明质粒plRES-EGFP已经进入卵巢的上述各种细胞中。 实验组小鼠进行卵巢内直接注射质粒DNA后，进行超排并收集受精卵，在体外进行培养，培养3-4天后，在荧光显微镜下观察发育到桑椹胚的胚胎，部分胚胎中可见较强的绿色荧光，发绿色荧光的胚胎的比率为68/92(74.1％)，这表明EGFP基因整合到小鼠的受精卵中且能够表达。 随机挑取性成熟的昆明白小鼠6只，进行卵巢内直接注射质粒plRES-EGFP，术后恢复48hr与同系的昆明白雄鼠交配，共获得了F1代小鼠171只，其中PCR检测为阳性的有111只，转基因阳性率为64.91％(111/171)，PCR产物测序结果与已知的EGFP基因的序列同源性为100％。另外，对EGFP在F1代小鼠中的表达进行检测，通过RT-PCR证实F1代小鼠的肾脏和肌肉中有EGFP基因的表达；随机挑取10只转基因F1代小鼠，分别收集其血液，经过洗涤及固定后用流式细胞仪进行EGFP表达的分析。结果发现6只转基因小鼠的血液中有EGFP的表达，其表达量在11％-80％。这说明利用卵巢内直接注射法注射质粒后，外源基因较高效率地整合到卵母细胞中，经受精后发育为转基因小鼠。 收集F1代转基因小鼠的卵巢、睾丸组织，甲醛固定后进行常规石蜡切片。原位杂交后发现两种组织中均有大量的阳性信号，说明F1代小鼠的卵巢和精巢中整合有EGFP基冈，为其遗传到一代提供了直接证据。在此期间，将性成熟的F1代转基冈雄鼠和雌鼠合笼，目前共得到F2代小鼠121只，其中PCR检测为阳性的有81只，阳性率为66.94％(8l/21)，进一步证实通过卵巢注射法获得的转基因小鼠具有可遗传性。 利用FISH技术对外源基因在F1代染色体中的整合位点进行了定位。在35只待检测鼠中，21只鼠的染色体分裂相杂交后能够观察到阳性信号，检出率为60％，并且发现整合发生在不同染色体上的不同位点，杂交结果中单一阳性信号与多个阳性信号的比率为3：18，这在染色体水平上证实了外源基因的插入，并且证明其整合是随机的。 根据小鼠基因组中的B1重复序列保守和EGFP基因的PolyA序列设计一对引物，对转基因阳性小鼠的基因组进行进一步的PCR检测，测序结果与gene bank中小鼠基因组序列比对，结果证明，外源基因整合在小鼠的1号染色体上lA3区，190，470K-190，480K之间。 本文在组织、细胞和分子水平上证实了将外源质粒DNA注射到性成熟小鼠的卵巢中，卵巢问质和各级卵母细胞能够吸收、整合外源DNA，并能够进行转录和翻译，这种整合和表达具有可遗传性，为卵巢内直接注射法制备转基因动物提供了理论依据。