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黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，EC1．2．3．22）是嘌呤代谢途径的关键酶，广泛分布于各种生物体的组织和细胞中，主要催化次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，进一步氧化黄嘌呤生成尿酸。临床上可用于制备免疫抗体、肿瘤抑制剂和细胞缺血性再灌注损伤等疾病的检测。根据辣根过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶的催化反应特性，本文提出了以偶联辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色，检测黄嘌呤氧化酶活力的新方法。最佳测定条件为：辣根过氧化物酶7000U·L-1，4-氨基安替比林1 mmol·L-1，苯酚6 mmol·L-1，黄嘌呤1 mmol·L-1溶于50 mmol·L-1Tris-HCL缓冲液（pH8．4）；反应温度为37℃，保温时间为20min；检测波长为508nm。本方法测定XOD酶活的线性范围为5．0～100．0U·L-1，线性关系良好（r=0．9992），检出限为1．3U·L-1。以黄嘌呤为唯一碳氮源，采用富集分离培养方法，在国内首次筛选获得一株产黄嘌呤氧化酶细菌。经生理生化鉴定和16S rDNA序列同源分析，确定其属于微球菌科节杆菌属，命名为Arthrobactersp．XL26，GenBank接受号为EF532600。此菌在种子培养基和发酵基本培养基中的生长情况表明，达到最高菌体生长量的培养时间分别为24h和42h，发酵培养45h可达最高产酶活力，表明该菌发酵合成黄嘌呤氧化酶基本属于生长偶联型。通过单因素扫描、Plackett-Burman、Box-Benken试验设计和响应面分析法优化了产酶发酵条件和培养基组成。最适发酵条件为：初始培养基pH8．5，培养温度32℃，接种量10％，摇瓶培养基装液比例30％，转速210 r·min-1；最适培养基组成为(g·L-1)：乳糖：葡萄糖（3：1）12．0，（NH4）2SO4 4．0，酵母粉2．13，黄嘌呤2．57，FeSO4·7H2O 0．5×10-3，MgSO4·7H2O 0．2×10-3，CaCl2 5．33×10-3，KH2PO4 0．94，Na2HPO4 5．92。优化后每升发酵液产XOD可达409．6U，而且比酶活比初始基本发酵提高了15倍。进一步采用间歇补料，产酶量又增加了35％。经过超声破碎、硫酸铵分级盐析、PEG6000／（NH4）2SO4双水相萃取、Butyl-Sepharose 4B疏水层析、DEAE Sepharose CL-6B FF离子交换、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤，从Arthrobacter sp．XL26中分离得到黄嘌呤氧化酶，其比酶活提高了270倍，达24 U·mg-1，回收率为11％。SDS-PAGE确定此蛋白含有两个大小不等的亚基，相对分子量分别约为55．48kDa和85．67 kDa。推断该酶为两个不同亚基构成的二聚体分子（α2β2）。酶学性质研究表明，来源于Arthrobacter sp．XL26的黄嘌呤氧化酶最适反应pH为8．0，最适温度为55℃；在pH7．0-9．0 Tris-HCl缓冲液中于25℃保温16h，剩余相对酶活高于80％；在35℃以下保温30min，酶活保持100％。以黄嘌呤和次黄嘌呤为底物的表观米氏常数分别为0．032mmol·L-1和0．133mmol·L-1。金属离子Cu2+和pb2+对XOD有强烈的抑制作用，Ag+和Hg2+完全抑制了酶活性；而Mn2+、Co2+和Ba2+对XOD的酶活性略有激活作用。化学物质中水杨酸钠、组胺、酒石酸钾钠、甘露醇、丙三醇、二硫苏糖醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）6000及表面活性剂Triton X-114对XOD酶均为XOD的激活剂，可显著提高酶反应的速率；叠氮钠和尿素可强烈抑制XOD酶活性；山梨醇和甘氨酸可以极大地提高酶热稳定作用。根据GenBank、EMBL和SWISS-PROT报导的黄嘌呤氧化酶蛋白保守序列，设计简并引物，以Arthrobacter sp．XL26基因组为模板，采用简并PCR、反向PCR和巢式PCR技术扩增获得编码黄嘌呤氧化酶A、B亚基基因的全长序列分别为1542bp和2355bp，Genbank上的登录号分别为EF648005和EF648204，推测其各编码513个氨基酸残基的A亚基肽链和784个氨基酸残基的B亚基肽链。同源性比对显示，xodA和xodB推导的氨基酸序列分别与来源于Acinetobacter baumannii ATCC 17978的黄嘌呤脱氢酶小亚基和大亚基同源性达到了92％和84％。蛋白质结构在线分析表明，Arthrobactersp．XL26黄嘌呤氧化酶的A、B亚基均属于（α+β）型蛋白，其中[2Fe-2S]结合位点和FAD结合域位于XODA肽链，而XODB肽链则含有钼蝶呤结合域及醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶特有的a／b锤头结合域。