论文部分内容阅读
与哺乳动物相比较,鱼类的获得性免疫系统较脆弱,固有免疫在抵抗外来病原入侵中发挥着极其重要的作用,石斑鱼的c型溶菌酶(Epinephelus coioides c type Lysozyme,Ec-c LYZ)是其体内重要的非特异性免疫因子之一,c LYZ不仅能抑制革兰氏阳性菌而且对革兰氏阴性菌也有抑制作用。人乳铁蛋白(Human Lactoferrin,h LTF)是主要存在于乳汁中的一种铁结合性糖蛋白,富含多种氨基酸,具有广谱的抗菌性及免疫作用、抗氧化作用、抗炎、抗病毒、抑癌等生物学功能。由于h LTF具有强烈螯合铁离子的作用,而铁元素几乎是所有细菌生长不可缺少的,因此,h LTF可以通过阻止细菌利用铁离子而发挥抑菌作用;其次,h LTF作为蛋白酶,还可以降解一些细菌的毒力,进而降低微生物的致病性。本研究通过构建Ec-c LYZ基因和h LTF基因的重组腺病毒,对其双基因协同抑菌效果进行评价。本试验根据Gen Bank中c LYZ基因序列(JQ287658.1)和h LTF基因序列(AY875691.1),设计特异性引物,分别从石斑鱼头肾组织和人乳体细胞中扩增得到c LYZ基因和h LTF基因,将目的基因分别连接于p MD-19T载体,命名为p MD-c LYZ和p MD-h LTF;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和穿梭质粒p DC315-MCS-EGFP进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭载体p DC315-c LYZ、p DC315-h LTF和p DC315-c LYZ-h LTF;将构建好的重组腺病毒穿梭质粒p DC315-c LYZ、p DC315-h LTF、p DC315-c LYZ-h LTF、对照质粒p DC315-MCS-EGFP和骨架质粒,在脂质体Lipofiter TM介导下共同转染HEK 293细胞,进行病毒的包装与扩增;收获的重组腺病毒能够感染HEK293细胞并引起细胞病变,通过RT-PCR检测到重组腺病毒在细胞内的复制,Western blotting检测外源蛋白在细胞内的表达;重组腺病毒经纯化后用50%组织培养感染计量法(TCID50)测定病毒滴度,将获得的阳性重组腺病毒分别命名为Ad-c LYZ、Ad-h LTF、Ad-c LYZ-h LTF和Ad-GFP;重组腺病毒转染细胞后,提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度,通过滤纸片法测定目的蛋白提取液对试验菌株的抑菌效果;通过测定目的蛋白对试验菌株的最小抑菌浓度,比较目的蛋白和常用抗生素对试验菌株的抑菌效果。试验结果显示:RT-PCR检测证实携带目的基因的重组腺病毒成功导入HEK293细胞;经Western blotting检测,包装后的重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF和Ad-c LYZ-h LTF能够在HEK293细胞中有效表达目的蛋白,并扩增形成大量病毒颗粒,表明包装好的重组腺病毒具有良好的感染性;重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF、Ad-c LYZ-h LTF和Ad-GFP经纯化后,用TCID50法测定病毒的滴度分别为109.54 TCID50/m L、109.25 TCID50/m L、109.87 TCID50/m L和109.16 TCID50/m L,证实高效表达外源蛋白的重组腺病毒具有稳定的感染性,且得到的病毒滴度符合后续试验要求;重组腺病毒Ad-c LYZ、Ad-h LTF和Ad-c LYZ-h LTF感染细胞后提取总蛋白,经测定,蛋白浓度分别为2.481 mg/m L、2.675 mg/m L和3.228 mg/m L;敏感性检测结果显示5种致病菌对表达的c LYZ蛋白、h LTF蛋白和双基因蛋白均较敏感,且双基因蛋白对试验菌株的抑制作用较强;无乳链球菌、金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳链球菌(ATCC9809)和大肠杆菌(K88)的MIC分别为37.5μg/m L、37.5μg/m L、37.5μg/m L、75μg/m L和150μg/m L;最小抑菌浓度的目的蛋白对试验菌株的抑菌效果与常用抗生素相当,甚至更优。本研究首次将石斑鱼c型溶菌酶的广谱抗菌效果、人乳铁蛋白的抑菌杀菌作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性相结合,表达上述基因的重组腺病毒,试验结果显示目的蛋白对试验菌株表现出良好的抑菌活性,为临床细菌性疾病的生物防治奠定了理论和试验基础。