论文部分内容阅读
目的:研究浓度为10%的香烟烟雾提取物(CSE)在不同时期对大鼠气管上皮细胞磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol -3-kinase, PI3K) / Akt、不典型蛋白激酶Cι/ζ(aPKCι/ζ)、Nrf2(Nuclear factor–E2 related factor)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达调控,阐明香烟烟雾对PI3K / Akt、aPKCι/ζ、Nrf2和核转位的影响及对γ-GCS表达调控在氧化/抗氧化机制中的作用。探讨PI3K特异性抑制剂LY294002、aPKCι/ζ特异性抑制剂RO-31-8220在香烟烟雾诱导的氧化应激情况下对大鼠气管上皮细胞Nrf2核转位和γ-GCS表达调控,阐明PI3K / Akt信号通路与aPKCι/ζ信号通路关系及PI3K / Akt、aPKCι/ζ对Nrf2的激活和核转位及对γ-GCS的表达水平和活性的影响在氧化/抗氧化机制中的作用。方法:实验共分两部分。将体外培养的气道上皮细胞用含20%FCS的DMEM/ F12培养基培养24h后随机分为两部分,一部分根据暴露10%CSE不同时期分为5组:0h对照组,暴露1h,3h,6h,12h组(CSE0h,CSE1h,CSE3h,CSE6h,CSE12h)。另一部分也分为5组:0h阴性对照组、CSE3h阳性对照组、LY294002组、RO-31-8220组和LY294002+RO-31-8220组,抑制剂组为在暴露CSE前0.5h加入10mM PI3K特异性抑制剂LY294002和/或3uM aPKCι/ζ特异性抑制剂RO-31-8220培养3h。观察香烟烟雾在不同时期、PI3K特异性抑制剂、aPKCι/ζ特异性抑制剂对大鼠气管上皮细胞Nrf2核转位及γ-GCS的影响;用免疫荧光及Western blot方法观察Nrf2核转位和胞浆、胞核蛋白质表达,免疫细胞化学、Western blot方法检测γ-GCS的表达水平;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析γ-GCS mRNA表达水平;流式细胞技术、Western blot方法分析p-Akt蛋白质表达水平和阳性细胞比率;Western blot方法检测aPKCι/ζ蛋白质表达水平;参照Tietze方法测体外培养气管上皮细胞还原型谷胱甘肽(GSH)的含量;参照双酶法测体外培养气管上皮细胞γ-GCS的活性。结果:第一部分:1.体外培养的气管上皮细胞经10%CSE处理后,GSH含量在1h降低,与对照组比较差异显著(P<0.05);3h较对照组增高(P<0.05),6h达高峰;12h恢复正常水平(P>0.05)。2. Nrf2在对照组、CSE12h组主要表达在胞浆,然而,在CSE 1h、3h、6h组主要表达在胞核;Nrf2胞核蛋白质在对照组有一定表达,暴露CSE后1h、3h、6h胞核蛋白质高表达,与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05),但各组间表达无明显差异,12h低表达,与对照组无显著性差异(P>0.05);Nrf2胞浆蛋白质在对照组和CSE12h组高表达,而在CSE1h、CSE3h、CSE6h组表达降低,各组间表达无明显差异,但与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05)。3. p-Akt蛋白质在对照组弱表达,当暴露CSE后1h,其蛋白质表达增高,3h达高峰,两组与对照组比较差异显著(P<0.05),6h降低,与对照组比较差异显著(P<0.05),12h保持低水平。表达p-Akt阳性细胞比率逐渐增强,3h达到最高,然后逐渐减少,6h恢复正常,12h维持低比率。4. p- aPKCι/ζ蛋白质在CSE1h组开始表达增高,在CSE3h组最高,约为正常的3倍,在CSE6h组表达减弱,三组与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05),CSE12h组表达低水平,与对照组无明显差异(P>0.05)。5. RT-PCR结果显示,当细胞暴露于CSE,γ-GCSmRNA、蛋白质和γ-GCS活性1h开始增强,3h明显增强,6h达最高水平,12h表达减弱,与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。γ-GCS蛋白质在对照组气管上皮细胞胞浆中呈弱阳性表达,CSE1h组、CSE3h组呈阳性表达,CSE6h组呈强阳性表达,而CSE12h组呈弱阳性表达。6.相关性分析示经10%CSE处理后的气管上皮细胞中,Nrf2与γ-GCS-h、γ-GCS活性、p-Akt和p-aPKCι/ζ呈正相关,γ-GCS与GSH、γ-GCS活性、aPKCι/ζ及Nrf2呈正相关, p-Akt与p-aPKCι/ζ及Nrf2成正相关, p-aPKCι/ζ与γ-GCS、γ-GCS活性、p-Akt及Nrf2成正相关(P<0.05)。第二部分:1.当预先予以PI3K特异性抑制剂LY294002和/或aPKCι/ζ特异性抑制剂RO-31-8220处理后,三组抑制剂组GSH含量较CS3h组减少(P<0.05),但比对照组高,有显著性差异(P<0.05),三组抑制剂组之间无显著性差异(P>0.05)。2. Nrf2在对照组主要表达部位在胞浆,在LY294002组、RO-31-8220组和两种抑制剂组中主要表达部位在胞核,提示PI3K特异性抑制剂LY294002和aPKCι/ζ特异性抑制剂RO-31-8220不影响Nrf2核转位。Nrf2胞核蛋白质在对照组弱表达,LY294002组、RO-31-8220组和两种抑制剂组表达增高,与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05),而与CSE3h组无显著性差异(P>0.05),三组抑制剂组之间无显著性差异(P>0.05)。3.γ-GCSmRNA、蛋白质在对照组呈低表达,LY294002组、RO-31-8220组和两种抑制剂组较对照组表达增强(P<0.05),较CSE3h低(P<0.05),三组抑制剂组之间无显著性差异(P>0.05)。γ-GCS蛋白质在对照组气管上皮细胞胞浆中呈弱阳性表达,在LY294002组、RO-31-8220组和两种抑制剂组呈阳性表达,CSE3h组呈强阳性表达。4.在LY294002组,p-Akt蛋白质和p- aPKCι/ζ蛋白质都低表达,在RO-31-8220组,p-Akt蛋白质高表达,而p- aPKCι/ζ低表达。在LY294002组,表达p-Akt阳性细胞比率降低,在RO-31-8220组,表达p-Akt阳性细胞比率增高。结论:1.香烟烟雾调节γ-GCS表达和GSH合成。2.体外培养的气管上皮细胞经香烟烟雾提取物处理后的一定时期Nrf2发生核转位,说明在氧化应激情况下,Nrf2可能是调控γ-GCS表达的关键转录因子。3. PI3k特异性抑制剂和aPKCι/ζ特异性抑制剂影响γ-GCS蛋白质、γ-GCS mRNA表达、γ-GCS活性和GSH含量,说明PI3k/Akt-Nrf2、aPKCι/ζ-Nrf2信号通路可能参与对γ-GCS表达调控过程。4. PI3k特异性抑制剂抑制p-aPKCι/ζ表达水平,而aPKCι/ζ特异性抑制剂不影响p-Akt表达,说明PI3k/Akt位于aPKCι/ζ上游。5.香烟烟雾产生氧化应激,可能通过PI3K/Akt-aPKCι/ζ- Nrf2途径调节γ-GCSmRNA和蛋白质的表达。