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苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki1.1752)属于芽孢杆菌科芽孢杆菌属,它在芽孢形成过程中能够产生具有杀虫作用的伴孢晶体。苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌等致病菌有很近的亲缘关系,对苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因的结构与功能的研究,有助于进一步阐明芽孢萌发的机制,为了解这些致病菌及筛选一些合适的抗性药物提供理论依据。苏云金芽孢杆菌产生的伴孢晶体在农业上已广泛应用于病虫害的防治,芽孢萌发分子机制的研究可以为构建更有效的工程菌株提供一些有益的启示。本论文以苏云金芽孢杆菌为材料开展了以下两部分研究工作。
本研究从苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种中克隆到一个与肌苷水解酶同源的基因-iunHo iunH的破坏不影响苏云金芽孢杆菌营养菌体的生长和产孢,但能够促进肌苷与腺苷诱导的芽孢萌发。在iunH阻断突变株中用多拷贝的质粒过表达iunH后肌苷与腺苷诱导的芽孢萌发率显著降低。在E.coli中表达和纯化了IunH蛋白,并进一步检测了它的酶学性质。IunH以肌苷作为底物的动力学常数为Km=399±115μM,kcat=48.9±8.5 s-1和kcat/Km=1.23×105 M-1 s-1。肌苷水解酶还能降解腺苷和鸟苷,但比活力相对较低。同时发现完整芽孢降解肌苷的比活力为2.89±0.23×10-2 mmol min-1每毫克干重。IunH在pH5.0到pH10.0范围内都能保持活力并且具有很强的热抗性,酶本身的热抗性与芽孢的热抗性是相一致的。这些结果说明肌苷水解酶降解肌苷与腺苷的活性在调节苏云金芽孢杆菌肌苷与腺苷诱导的芽孢萌发中起到重要作用。
此外,从苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种中克隆到一个与蜡状芽孢杆菌gerR操纵子相似的gerA操纵子。实验表明gerA操纵子在产孢起始三个小时后开始转录。gerA的破坏阻断了L-丙氨酸诱导的芽孢萌发,并且延迟了肌苷诱导的萌发。在L-丙氨酸诱导芽孢萌发的过程中D-环丝氨酸能够不可逆的抑制丙氨酸消旋酶的活性从而提高芽孢的萌发率。