论文部分内容阅读
植物油脂是人类日常生活所必需的重要营养物质之一，也是潜在的可再生生物质能源，并且是重要的工业原料。由于人口增长、经济发展、农产品消费结构变化等因素的影响，国内外植物油脂市场需求量迅速上升，对品质的要求也不断提高。培育高油作物品种是增加油脂产量的有效途径。应用分子生物学方法解析植物油脂合成的分子机制，分离油脂合成相关基因，已成为油料作物分子育种的重要方向。花生是世界范围内重要的油料作物之一，其种子含油量可达50%以上，并具有进一步提高的潜力。为了深入研究和阐释花生油脂合成的分子机制，本实验室构建了花生发育种子的全长cDNA文库。本研究从该文库中分离克隆到与花生脂肪酸生物合成和油脂积累相关的功能基因和调控基因的表达序列，通过多种技术研究了所克隆基因的表达特性、在提高油脂含量中的作用及其分子机制。本研究结果对于阐明花生油脂合成及调控机制有重要理论意义，对于进一步提高花生含油量和改良油脂品质也具有潜在应用价值。主要研究结果如下。1、克隆到编码花生溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAT）的2个基因，命名为AhLPAT2和AhLPAT4，全长分别为1753bp和1631bp，分别编码387和383个氨基酸。上述两个基因分别编码的AhLPAT2和AhLPAT4蛋白与拟南芥AtLPAT2（Q8LG50）和大豆GmLPAT4（XP003544428）的亲缘关系较近。通过Southern杂交，发现AhLPAT2以多拷贝形式存在于栽培花生基因组中。通过亚细胞定位发现AhLPAT2和AhLPAT4表达的蛋白均定位于膜上，属于膜结合蛋白。通过花生不同组织的荧光定量PCR分析，发现AhLPAT2和AhLPAT4在根、茎、叶、花、果针和种子中均有表达，其中AhLPAT2在种子中的表达量最高，而且发育种子中AhLPAT2转录本积累与含油量积累速率变化一致。2、通过AhLPAT2基因的特异表达载体构建和转化拟南芥，发现转基因拟南芥种子重量明显增加，种子脂肪酸总量明显提高，不饱和脂肪酸比例尤其是亚麻酸（C18:3）的含量极显著提高，但种子蛋白质含量降低，说明AhLPAT2过表达可显著增加种子的含油量。通过转基因拟南芥角果的荧光定量PCR分析，证实该基因在转基因植株中参与脂肪酸合成、TAG组装、蔗糖代谢和糖酵解途径的关键基因表达上调。3、克隆到花生关键转录因子基因AhLEC1-like的4条全长cDNA，分为AhLEC1-likeA和AhLEC1-likeB两种类型。两个基因所分别编码的AhLEC1-likeA和AhLEC1-likeB与已报道的可可TcLEC1-like（CAM35799）的同源性达75%以上，与拟南芥和油菜的LEC1-like型HAP3家族成员也有较高同源性，它们均定位于细胞核中，且具有多个转录激活区。荧光定量PCR分析发现AhLEC1-likeA和AhLEC1-likeB在花生种子中表达量较高，并与种子油脂积累进程同步。4、通过在拟南芥中组成型过量表达和种子特异表达AhLEC1-likeA基因，发现转基因T2和T3代植株种子各个脂肪酸组分含量均稳定提高，C16:0和C18:2的比例比野生型显著降低，C20:1和不饱和脂肪酸总量的比例较野生型增加，C18脂肪酸的比例降低，C20脂肪酸的比例提高。通过转基因拟南芥植株荧光定量PCR分析，明确了AhLEC1-likeA诱导脂肪酸合成相关基因的上调表达，其中以FAD2和KCS18的上调最为明显，蔗糖代谢和糖酵解途径以及胚胎发生关键转录因子编码基因也上调表达。与已有研究报道不同的是，本实验转基因植株的胚胎和种子发育未受AhLEC1-likeA基因的影响。